• Facebook
  • linkedin
  • youtube

1. Ανιχνεύστε την απορρόφηση του διαλύματος RNA

Η απορρόφηση στα 280, 320, 230 και 260 nm αντιπροσωπεύει τις τιμές του νουκλεϊκού οξέος, του υποβάθρου (θολότητα διαλύματος), της συγκέντρωσης άλατος και της οργανικής ύλης όπως πρωτεΐνη, αντίστοιχα.Γενικά κοιτάξτε μόνο το OD260/OD280 (Ratio, R).Όταν 1,8~2,0, πιστεύουμε ότι η μόλυνση πρωτεΐνης ή άλλης οργανικής ύλης στο RNA μπορεί να είναι ανεκτή, αλλά πρέπει να σημειωθεί ότι όταν χρησιμοποιείται το Tris ως ρυθμιστικό διάλυμα για την ανίχνευση της απορρόφησης, η τιμή R μπορεί να είναι μεγαλύτερη από 2 (γενικά πρέπει να είναι <2,2).Όταν R<1,8, η ρύπανση πρωτεΐνης ή άλλης οργανικής ύλης στο διάλυμα είναι πιο εμφανής και η τύχη του RNA μπορεί να προσδιοριστεί ανάλογα με τις ανάγκες.Όταν R>2.2, σημαίνει ότι το RNA έχει υδρολυθεί σε απλό νουκλεϊκό οξύ.
 
2.Ηλεκτροφορητικό σχέδιο του RNA
Γενικά, η μετουσιωτική γέλη χρησιμοποιείται για ηλεκτροφόρηση RNA, αλλά εάν είναι μόνο για την ανίχνευση της ποιότητας του RNA, η γέλη μετουσίωσης δεν είναι απαραίτητη και μπορεί να χρησιμοποιηθεί συνηθισμένη γέλη αγαρόζης.Ο σκοπός της ηλεκτροφόρησης είναι να ανιχνεύσει την ακεραιότητα των ζωνών 28S και 18S και την αναλογία τους ή την ακεραιότητα του επιχρίσματος mRNA.Γενικά, εάν οι ζώνες 28S και 18S είναι φωτεινές, καθαρές και ευκρινείς (αναφερόμενοι στις άκρες των ζωνών είναι καθαρές) και η φωτεινότητα του 28S είναι υπερδιπλάσια από αυτή της ζώνης 18S, θεωρούμε ότι η ποιότητα του RNA είναι καλή.
Οι παραπάνω είναι οι δύο μέθοδοι που χρησιμοποιούμε συνήθως, αλλά καμία από αυτές τις δύο μεθόδους δεν μπορεί να μας πει ξεκάθαρα εάν υπάρχει υπολειμματική RNase στο διάλυμα RNA.Εάν υπάρχει πολύ μικρή ποσότητα RNase στο διάλυμα, είναι δύσκολο να την ανιχνεύσουμε με την παραπάνω μέθοδο, αλλά οι περισσότερες από τις επόμενες ενζυματικές αντιδράσεις πραγματοποιούνται σε θερμοκρασία άνω των 37 βαθμών και για μεγάλο χρονικό διάστημα.Με αυτόν τον τρόπο, εάν υπάρχει πολύ μικρή ποσότητα RNase στο διάλυμα RNA, τότε θα υπάρχει πολύ κατάλληλο περιβάλλον και χρόνος για να παίξουν το ρόλο τους στα επόμενα πειράματα και φυσικά το πείραμα θα είναι κρύο αυτή τη στιγμή.Παρακάτω εισάγουμε μια μέθοδο που μπορεί να επιβεβαιώσει εάν υπάρχει υπολειμματική RNase στο διάλυμα RNA.
 
3. Δοκιμή διατήρησης θερμότητας
Σύμφωνα με τη συγκέντρωση του δείγματος, τραβήξτε δύο 1000 ng RNA από το διάλυμα RNA και προσθέστε το σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης 0,5 ml και συμπληρώστε το με ρυθμιστικό διάλυμα Tris pH 7,0 σε συνολικό όγκο 10 ul και στη συνέχεια σφραγίστε το καπάκι του σωλήνα.Βάλτε ένα από αυτά σε υδατόλουτρο σταθερής θερμοκρασίας στους 70°C και διατηρήστε το ζεστό για 1 ώρα.Το άλλο μέρος φυλάχθηκε σε ψυγείο -20°C για 1 ώρα.Όταν περάσει ο χρόνος, αφαιρέστε τα δύο δείγματα για ηλεκτροφόρηση.Αφού ολοκληρωθεί η ηλεκτροφόρηση, συγκρίνετε τις ηλεκτροφορητικές ζώνες των δύο.Εάν οι ζώνες των δύο είναι συνεπείς ή δεν έχουν σημαντική διαφορά (φυσικά, οι ζώνες τους πληρούν επίσης τις προϋποθέσεις της μεθόδου 2), σημαίνει ότι δεν υπάρχει υπολειμματική μόλυνση με RNase στο διάλυμα RNA και η ποιότητα του RNA είναι πολύ καλή.Αντίθετα, εάν το δείγμα που επωάστηκε στους 70°C εμφανίσει εμφανή αποικοδόμηση, υποδηλώνει ότι υπάρχει μόλυνση με RNase στο διάλυμα RNA.
 
2 Πειραματικές μέθοδοι και τεχνικές εκχύλισης RNA
Τα προβλήματα που αντιμετωπίζουμε συχνά κατά την εξαγωγή RNA είναι: (1) Η απόδοση RNA είναι χαμηλή.(2) Το RNA έχει σοβαρή ρύπανση από αλάτι.(3) Το RNA έχει σοβαρή ρύπανση από οργανικούς διαλύτες.(4) υποβάθμιση του δείγματος και άλλα προβλήματα
 
1. Συνήθως χρησιμοποιούνται αντιδραστήρια εξαγωγής ολικού RNA
Η μέθοδος ισοθειοκυανικής γουανιδίνης και η μέθοδος Trizol είναι οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μέθοδοι για την εξαγωγή ολικού RNA από ζωικούς ιστούς και ζωικά κύτταρα.Είναι ιδιαίτερα κατάλληλο για μικρά δείγματα και ιστούς που είναι ιδιαίτερα δύσκολο να εξαχθούν, όπως η εξαγωγή ολικού RNA από δέρμα κουνελιού και συνδετικό ιστό ζώων.Επιπλέον, το Trizol, ως αντιδραστήριο λύσης γενικής χρήσης, μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την εξαγωγή φυτικών ιστών, βακτηρίων, μυκήτων και άλλων ιστών.Για φυτικούς ιστούς που περιέχουν πολυσακχαρίτες και πολυφαινόλες, όπως camellia oleifera, φύλλα τσαγιού, ελαιοκράμβη κ.λπ., η μέθοδος CTAB μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την εξαγωγή ολικού RNA.

Ως συμβατική μέθοδος, η μέθοδος διπλής στήλης είναι επίσης πολύ δημοφιλής λόγω της λειτουργίας της σε κανονική θερμοκρασία, της μη ανάγκης προσθήκης RNase και της ασφάλειας—χωρίς χλωροφόρμιο, φαινόλες και άλλα οργανικά αντιδραστήρια για εκχύλιση.(προτεινόμενα προϊόντα )

1
2

2. Εξαγωγή ολικού RNA από ζωικούς ιστούς
 
(1) Προσπαθήστε να επιλέξετε φρέσκο ​​χαρτομάντιλο, εάν δεν είναι φρέσκο ​​(κατά προτίμηση εντός τριών μηνών - ψυγείο 80 ℃ ή παγωμένο σε υγρό άζωτο. Όταν κόβετε χαρτομάντιλο, μην το κόβετε απευθείας σε θερμοκρασία δωματίου, φροντίστε να το βάλετε στο κουτί πάγου, προσπαθήστε να αποφύγετε την επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη.
(2) Χρησιμοποιήστε καθαρό ψαλίδι και τσιμπιδάκι για να κόψετε ένα μικρό κομμάτι ιστού, προσπαθήστε να κόψετε το κεντρικό τμήμα του ιστού όταν κόβετε το δείγμα ή κόψτε πρώτα το μεγάλο κομμάτι ιστού από τη μέση και μετά κόψτε το δείγμα στη θέση φρέσκιας τομής.Ο ιστός που αφαιρέθηκε πρέπει να τεμαχιστεί πλήρως, να τοποθετηθεί ο τεμαχισμένος ιστός σε ένα σωλήνα EP χωρίς RNase, να προσθέσετε το προϊόν λύσης, ο τεμαχισμένος ιστός πρέπει να εκτεθεί πλήρως στο προϊόν λύσης και να προετοιμαστεί για ομογενοποίηση.

(3) Για φυσιολογικούς ιστούς, επιλέξτε ιστούς μεγέθους φασολιού mung (30-60 mg) για ομογενοποίηση.Εάν οι ιστοί περιέχουν μεγάλη ποσότητα πρωτεΐνης, λίπους ή πυκνούς ινώδεις ιστούς όπως το συκώτι, αυξήστε ή μειώστε κατάλληλα την ποσότητα των κομμένων ιστών (προαιρετικά) Επιλέξτε 10~20 mg).
(4) Εάν εκχυλιστούν μυς ψαριών, κρέας γαρίδας, μέδουσες και άλλοι ιστοί με υψηλή περιεκτικότητα σε νερό, ο όγκος του δείγματος θα πρέπει να αυξηθεί κατάλληλα (συνιστάται 100-200 mg).
(5) Εάν οι συνθήκες το επιτρέπουν, ο ζωικός ιστός μπορεί να εξαχθεί απευθείας αφού ομογενοποιηθεί με ομογενοποιητή ιστού υψηλής διέλευσης, εάν δεν υπάρχει τέτοιος εξοπλισμός.
(6) Το RNA που λαμβάνεται μετά την τελική εκχύλιση πρέπει να τοποθετηθεί αμέσως στο παγοθήκη για να μειωθεί η αποικοδόμηση του RNA.

3. Εκχύλιση RNA ζωικών κυττάρων

(1) Κύτταρα εναιωρήματος: φυγοκεντρήστε απευθείας και απορρίψτε το μέσο, ​​πλύνετε με αποστειρωμένο PBS για 1-2 φορές, κατόπιν εναιωρήστε με κατάλληλη ποσότητα PBS και στη συνέχεια προσθέστε το κυτταρόλυμα για λύση.Μην προσθέτετε το προϊόν λύσης απευθείας στα καταβυθισμένα κύτταρα μετά την πλήρη απόρριψη του υγρού.Αυτό θα αναγκάσει τη συσκευασία ιστόνης που απελευθερώνεται μετά τα λυμένα κύτταρα στο εξωτερικό στρώμα να προσκολληθούν στο εξωτερικό των κατακρημνισμένων κυττάρων, περιορίζοντας έτσι την επαφή των κυττάρων μέσα στο ίζημα με το προϊόν λύσης., με αποτέλεσμα ατελή κυτταρική λύση και μειωμένη απόδοση RNA.

(2) Κύτταρα που είναι ημι-προσκολλημένα ή όχι σφιχτά: Αφού απορρίψετε το μέσο, ​​πλύνετε με PBS για 1-2 φορές, στη συνέχεια απορροφήστε απευθείας μια κατάλληλη ποσότητα PBS και φυσήξτε το δίσκο καλλιέργειας με μια πιπέτα ή πιστόλι για να φυσήξετε τα κύτταρα και μεταφέρετέ τα σε κύτταρα χωρίς RNA.Προσθέστε το προϊόν λύσης στο σωλήνα EP του ενζύμου για εκχύλιση.

(3) Προσκολλημένα κύτταρα: πρέπει πρώτα να υποστούν πέψη με θρυψίνη, στη συνέχεια να συλλεχθούν σε σωλήνες EP χωρίς RNase, να φυγοκεντρηθούν για να απομακρυνθεί το υπερκείμενο, να πλυθούν 1-2 φορές με PBS για να απομακρυνθεί η περίσσεια θρυψίνης και να εναιωρηθούν εκ νέου με κατάλληλη ποσότητα PBS. Στη συνέχεια προχωρήστε στο βήμα εκχύλισης.

4. Εκχύλιση φυτικού RNA

Οι φυτικοί ιστοί είναι πλούσιοι σε φαινολικές ενώσεις ή πλούσιοι σε πολυσακχαρίτες ή περιέχουν κάποιους μη αναγνωρισμένους δευτερογενείς μεταβολίτες ή έχουν υψηλή δραστικότητα RNase.Αυτές οι ουσίες συνδυάζονται στενά με το RNA μετά την κυτταρική λύση για να σχηματίσουν αδιάλυτα σύμπλοκα ή κολλοειδή ιζήματα, τα οποία είναι δύσκολο να αφαιρεθούν.Επομένως, όταν εξάγουμε φυτικό ιστό, πρέπει να επιλέξουμε ένα κιτ για φυτά.Το προϊόν λύσης στο κιτ μπορεί να λύσει αποτελεσματικά τα προβλήματα της εύκολης οξείδωσης των πολυφαινολών και του διαχωρισμού των ενώσεων πολυσακχαρίτη και των νουκλεϊκών οξέων.

(Για εκχύλιση φυτικού RNA από πολυσακχαρίτη πολυφαινόλης, συνιστώμενα προϊόντα:

(1) Η φλούδα, ο πολτός, οι σπόροι, τα φύλλα κ.λπ. του φυτού πρέπει να αλεσθούν πλήρως σε γουδί.Κατά τη διαδικασία άλεσης, το υγρό άζωτο πρέπει να αναπληρώνεται εγκαίρως για να αποφευχθεί η τήξη του δείγματος.Το αλεσμένο δείγμα πρέπει να προστεθεί γρήγορα στο προϊόν λύσης και να ανακινηθεί για να αποφευχθεί η αποικοδόμηση του RNA.

(2) Για δείγματα πλούσια σε ίνες όπως φύλλα ρυζιού και σιταριού, η ποσότητα της εκχύλισης θα πρέπει να μειωθεί κατάλληλα, διαφορετικά η άλεση και η λύση του ιστού δεν θα ολοκληρωθούν, με αποτέλεσμα χαμηλή απόδοση εκχυλισμένου RNA.

(3) Για φυτικούς ιστούς με υψηλή περιεκτικότητα σε νερό, όπως καρπός ροδιού, καρπούζι, καρπός ροδάκινου κ.λπ., το μέγεθος του δείγματος θα πρέπει να αυξηθεί κατάλληλα (100-200 mg είναι προαιρετικό).

(4) Οι φυτικοί ιστοί, όπως τα φύλλα φυτών, τα ριζώματα, οι σκληροί καρποί και άλλα υλικά γενικά συνιστάται να χρησιμοποιούν υγρό άζωτο για να κονιάσετε καλά τα συστατικά σε ένα γουδί και στη συνέχεια να προχωρήσετε στο βήμα εκχύλισης.Οι συμβατικοί ομογενοποιητές ιστών μπορεί να μην είναι αποτελεσματικοί στην ομογενοποίηση φυτικών ιστών και γενικά δεν συνιστώνται.

5. Προφυλάξεις για την εξαγωγή RNA

(1) Τα δείγματα ιστών πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πιο φρέσκα για να αποφευχθεί η επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη.

(2) Ο ιστός πρέπει να αλεσθεί πλήρως κατά την εξαγωγή και η ποσότητα του ιστού δεν πρέπει να είναι πολύ μικρή, πόσο μάλλον πολύ.

(3) Θα πρέπει να δοθεί επαρκής χρόνος επώασης μετά την προσθήκη του προϊόντος λύσης για την πλήρη λύση του δείγματος.

(4) Κατά τη χρήση της μεθόδου Trizol για εκχύλιση, η αρχή της απορρόφησης του υπερκειμένου μετά τη στρωματοποίηση είναι "προτιμήστε να εισπνέετε λιγότερο από να εισπνέετε περισσότερο" και δεν πρέπει να εκχυλίζετε στη μεσαία στιβάδα, διαφορετικά θα προκαλέσει σοβαρή μόλυνση του γονιδιωματικού DNA.

(5) Κατά το πλύσιμο, το υγρό πλυσίματος πρέπει να διεισδύει πλήρως γύρω από το τοίχωμα του σωλήνα για να διασφαλιστεί η σχολαστική πλύση.

(6) Για τη μέθοδο εκχύλισης στήλης, εκτός από την αποκόλληση της στήλης μετά το πλύσιμο, η στήλη προσρόφησης θα πρέπει επίσης να τοποθετηθεί σε έναν εξαιρετικά καθαρό πάγκο και να εμφυσηθεί για 5-10 λεπτά για να εξατμιστεί πλήρως ο οργανικός διαλύτης μέχρι ξηρού.

(7) Στην τελευταία έκλουση της μεθόδου στήλης, μετά την προσθήκη νερού DEPC, θα πρέπει να επωαστεί για 3-5 λεπτά ή το νερό DEPC θα πρέπει να θερμανθεί στους 60°C εκ των προτέρων για να αυξηθεί η απόδοση έκλουσης.Στην παραδοσιακή μέθοδο διάσπασης Trizol και κατακρήμνισης ισοπροπανόλης, το τελικό RNA διαλύεται σε νερό DEPC, επομένως θα πρέπει να δοθεί κατάλληλος χρόνος για διάλυση και ο πυθμένας του σωλήνα φυγοκέντρησης πρέπει να φυσάται συνεχώς με ένα άκρο πιπέτας.

3 Τhree Αιτίες και λύσεις για χαμηλή συγκέντρωση RNA/κακή ποιότητα
 
1. Η απόδοση είναι πολύ χαμηλή
Το εξαγόμενο δείγμα είναι πολύ χαμηλό, η συνολική ποσότητα είναι ανεπαρκής ή το δείγμα που εξάγεται είναι πολύ και η λύση δεν έχει ολοκληρωθεί.Ο ιστός ή τα κύτταρα κατάλληλης ποιότητας θα πρέπει να χρησιμοποιούνται για εξαγωγή, η προεπεξεργασία του δείγματος πρέπει να γίνεται καλά και η λύση πρέπει να είναι επαρκής.
 
2. Υπολείμματα γονιδιώματος
Κατά την εκχύλιση με τη μέθοδο Trizol, όταν το υπερκείμενο αναρροφάται στη μεσαία στιβάδα μετά την επίστρωση, θα προκληθεί σοβαρή μόλυνση του γονιδιώματος.Θα πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή κατά τη στρώση για να αποφευχθεί το πιπίλισμα στο μεσαίο στρώμα.Εάν χρησιμοποιείται η μέθοδος στήλης για εξαγωγή, μπορεί να επιλεγεί ένα κιτ που περιέχει DNase I για εξαγωγή.Το νουκλεϊκό οξύ που προσροφάται στη μεμβράνη χωνεύεται απευθείας με DNase I, η οποία μπορεί να μειώσει σημαντικά τα υπολείμματα DNA.
 
3. Αποικοδόμηση RNA
Μπορεί να είναι η αποικοδόμηση του ίδιου του εξαγόμενου δείγματος ή η αποδόμηση που προκαλείται κατά τη διαδικασία εκχύλισης.Στο μέτρο του δυνατού, φρέσκα δείγματα θα πρέπει να χρησιμοποιούνται για την εκχύλιση RNA και τα δείγματα που συλλέγονται θα πρέπει να φυλάσσονται έγκαιρα σε υγρό άζωτο ή σε ψυγείο -80°C και θα πρέπει να αποφεύγεται η επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη.Στη διαδικασία εκχύλισης RNA θα πρέπει να χρησιμοποιούνται αιχμές χωρίς RNase/DNase, σωλήνες φυγοκέντρησης και άλλα υλικά.Η διαδικασία εξαγωγής πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πιο γρήγορη.Το εξαγόμενο RNA θα πρέπει να τοποθετηθεί σε παγοθήκη και να αποθηκευτεί στους -80°C στο χρόνο.Εάν το εξαγόμενο RNA πρέπει να ανιχνευθεί με ηλεκτροφόρηση γέλης, θα πρέπει να πραγματοποιηθεί ηλεκτροφόρηση αμέσως μετά την εκχύλιση και το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης θα πρέπει να αντικατασταθεί με ένα πρόσφατα παρασκευασμένο.
 
4. Αλάτι και υπολείμματα οργανικών διαλυτών
Τα αντιδραστήρια εκχύλισης περιέχουν άλατα φαινόλης και γουανιδίνης και το διάλυμα πλύσης περιέχει αιθανόλη.Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας εκχύλισης, το προϊόν λύσης δεν απορροφήθηκε πλήρως και δεν απορρίφθηκε και το διάλυμα πλύσης δεν ξηράνθηκε πλήρως.Τα υπολειμματικά άλατα και οι οργανικοί διαλύτες είναι επιβλαβείς για την επακόλουθη αντίστροφη μεταγραφή και PCR.Διαφορετικοί βαθμοί αναστολής, επομένως το κυτταρόλυμα θα πρέπει να αφαιρεθεί πλήρως κατά τη διάρκεια της διαδικασίας εκχύλισης και η πλύση θα πρέπει να είναι επαρκής ώστε τα περιβάλλοντα τοιχώματα του σωλήνα να μπορούν να πλυθούν.Επιπλέον, το άδειασμα του σωλήνα και η εμφύσηση είναι ένα απαραίτητο βήμα, το οποίο θα μειώσει περαιτέρω τα υπολείμματα οργανικής ύλης.
 
Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την εξαγωγή RNA, ακολουθήστε τον ιστότοπό μας:
www.foreivd.com για περισσότερες πληροφορίες.

7

Ώρα δημοσίευσης: Δεκ-01-2022