Αρκετές επαναστατικές εφευρέσεις στην ιστορία της τεχνολογίας ανίχνευσης στο μυαλό μου είναι η τεχνολογία ανοσοσήμανσης που βασίζεται στην αρχή της ειδικής δέσμευσης αντιγόνου-αντισώματος, της τεχνολογίας PCR και της τεχνολογίας προσδιορισμού αλληλουχίας.Σήμερα θα μιλήσουμε για την τεχνολογία PCR.Σύμφωνα με την εξέλιξη της τεχνολογίας PCR, οι άνθρωποι συνήθως διαιρούν την τεχνολογία PCR σε τρεις γενιές: συνηθισμένη τεχνολογία PCR, τεχνολογία φθορισμού ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο και τεχνολογία ψηφιακής PCR.
Cκοινή τεχνική PCR
KARY MULLIS (28.12.1944-2019.8.7)
Ο Kary Mullis εφηύρε την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, PCR) το 1983. Λέγεται ότι όταν οδηγούσε την κοπέλα του, ξαφνικά ένιωσε μια λάμψη έμπνευσης και σκέφτηκε την αρχή της PCR (για τα οφέλη της οδήγησης).Ο Kary Mullis τιμήθηκε με το Νόμπελ Χημείας το 1993. Οι New York Times σχολίασαν: «Πολύ πρωτότυπο και σημαντικό, που σχεδόν χωρίζει τη βιολογία σε προ-PCR και μετά-PCR εποχές.
Η αρχή της PCR: Κάτω από την κατάλυση της DNA πολυμεράσης, το DNA της μητρικής αλυσίδας χρησιμοποιείται ως εκμαγείο και ο συγκεκριμένος εκκινητής χρησιμοποιείται ως σημείο εκκίνησης επέκτασης και το DNA θυγατρικού κλώνου που είναι συμπληρωματικό στο DNA του μητρικού κλώνου αντιγράφεται in vitro μέσω μετουσίωσης, ανόπτησης, επέκτασης και άλλων σταδίων.Είναι μια τεχνολογία ενίσχυσης σύνθεσης DNA in vitro, η οποία μπορεί να ενισχύσει γρήγορα και συγκεκριμένα οποιοδήποτε DNA στόχο in vitro.
Πλεονεκτήματα της συνηθισμένης PCR
1.Κλασική μέθοδος, ολοκληρωμένες διεθνείς και εγχώριες προδιαγραφές
2.Χαμηλότερο κόστος των αντιδραστηρίων οργάνων
3.Τα προϊόντα PCR μπορούν να ανακτηθούν για άλλα πειράματα μοριακής βιολογίας
Προτεινόμενη μηχανή PCR Foregene: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Σχετικά προϊόντα: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Μειονεκτήματα της συνηθισμένης PCR
1.εύκολο να ρυπάνει
2.δυσκίνητη λειτουργία
3.μόνο ποιοτική ανάλυση
4.Μέτρια ευαισθησία
5.Υπάρχει μη ειδική ενίσχυση και όταν η μη ειδική ζώνη έχει το ίδιο μέγεθος με τη ζώνη στόχου, δεν μπορεί να διακριθεί
CPCR βασισμένη σε τριχοειδείς ηλεκτροφόρηση
Ως απάντηση στις αδυναμίες της συνηθισμένης PCR, ορισμένοι κατασκευαστές έχουν εισαγάγει όργανα που βασίζονται στην αρχή της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης.Το βήμα ηλεκτροφόρησης μετά την ενίσχυση PCR ολοκληρώνεται στο τριχοειδές.Η ευαισθησία είναι υψηλότερη και η διαφορά πολλών βάσεων μπορεί να διακριθεί και η ενίσχυση μπορεί να υπολογιστεί με MAERKER.περιεχόμενο του προϊόντος.Το μειονέκτημα είναι ότι το προϊόν PCR πρέπει ακόμα να ανοιχτεί και να μπει στο όργανο και εξακολουθεί να υπάρχει μεγάλος κίνδυνος μόλυνσης.
CτριχοειδέςEλεκτροφόρηση
2. Τεχνολογία fluorescent quantitative PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) σε πραγματικό χρόνοΗ φθορίζουσα ποσοτική PCR, που ονομάζεται επίσης Real-Time PCR, είναι μια νέα ποσοτική τεχνολογία νουκλεϊκών οξέων που αναπτύχθηκε από την PE (Perkin Elmer) το 1995. Η ιστορία ανάπτυξης της φθορίζουσας ποσοτικής PCR είναι μια ιστορία συγκλονιστικών αγώνων γιγάντων όπως οι ABI, Roche και Bio-Rad.Εάν ενδιαφέρεστε, μπορείτε να το ελέγξετε.Αυτή η τεχνική είναι σήμερα η πιο ώριμη και ευρέως χρησιμοποιούμενη ημι-ποσοτική τεχνική PCR.
Προτεινόμενη μηχανή qPCR:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Μέθοδος φθορίζουσας βαφής (SYBR Green I):Το SYBR Green I είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη βαφή δέσμευσης DNA για ποσοτική PCR, η οποία συνδέεται μη ειδικά με δίκλωνο DNA.Στην ελεύθερη κατάσταση, το SYBR Green εκπέμπει ασθενή φθορισμό, αλλά μόλις συνδεθεί με δίκλωνο DNA, ο φθορισμός του αυξάνεται 1000 φορές.Επομένως, το συνολικό σήμα φθορισμού που εκπέμπεται από μια αντίδραση είναι ανάλογο με την ποσότητα του δίκλωνου DNA που υπάρχει και θα αυξάνεται με την αύξηση του ενισχυμένου προϊόντος.Εφόσον η χρωστική δεσμεύεται μη ειδικά με δίκλωνο DNA, ενδέχεται να δημιουργηθούν ψευδώς θετικά αποτελέσματα.
Σχετικά προϊόντα: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Μέθοδος ανιχνευτή φθορισμού (τεχνολογία Taqman): Κατά τη διάρκειαΕνίσχυση PCR, ένας ειδικός φθορίζων ανιχνευτής προστίθεται ταυτόχρονα με ένα ζεύγος εκκινητών.Ο ανιχνευτής είναι ένα γραμμικό ολιγονουκλεοτίδιο, με μια φθορίζουσα ομάδα αναφοράς και μια ομάδα φθορίζουσας απόσβεσης αντίστοιχα σημασμένα και στα δύο άκρα.Όταν ο ανιχνευτής είναι άθικτος, το φθορίζον σήμα που εκπέμπεται από την ομάδα αναφοράς απορροφάται από την ομάδα απόσβεσης και η ανίχνευση Δεν υπάρχει σήμα φθορισμού.κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης PCR (στο στάδιο επέκτασης), η δραστηριότητα 5'-3' Dicer του ενζύμου Taq θα αφομοιώσει και θα αποικοδομήσει τον ανιχνευτή, έτσι ώστε η ομάδα φθορισμού αναφοράς και η ομάδα φθορισμού σβέσης να διαχωρίζονται, έτσι ώστε το σύστημα παρακολούθησης φθορισμού να μπορεί να ληφθεί, δηλαδή, κάθε φορά που λαμβάνεται ένα πλήρες DNA συγχρονισμός της συσσώρευσης φθοριζόντων σημάτων και του σχηματισμού προϊόντων PCR.Η μέθοδος ανίχνευσης Taqman είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος ανίχνευσης στην κλινική ανίχνευση.
Σχετικά προϊόντα: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Πλεονεκτήματα της qPCR
1.Η μέθοδος είναι ώριμη και ο υποστηρικτικός εξοπλισμός και τα αντιδραστήρια είναι πλήρης
2.Μέσο κόστος αντιδραστηρίων
3.εύχρηστος
4.Υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα ανίχνευσης
Μειονεκτήματα της qPCR
Η μετάλλαξη του γονιδίου στόχου οδηγεί σε μη ανίχνευση.
Το αποτέλεσμα ανίχνευσης του προτύπου χαμηλής συγκέντρωσης δεν μπορεί να προσδιοριστεί.
Υπάρχει μεγάλο σφάλμα κατά τη χρήση της τυπικής καμπύλης για ποσοτική ανίχνευση.
3. Τεχνολογία ψηφιακής PCR (ψηφιακή PCR, dPCR).
Η ψηφιακή PCR είναι μια τεχνική για τον απόλυτο ποσοτικό προσδιορισμό των μορίων νουκλεϊκού οξέος.Σε σύγκριση με το qPCR, η ψηφιακή PCR μπορεί να διαβάσει απευθείας τον αριθμό των μορίων DNA/RNA, που είναι ο απόλυτος ποσοτικός προσδιορισμός των μορίων νουκλεϊκού οξέος στο αρχικό δείγμα.Το 1999, ο Bert Vogelstein και ο Kenneth W. Kin-zler πρότειναν επίσημα την έννοια της dPCR.
Το 2006, η Fluidigm ήταν η πρώτη που παρήγαγε ένα εμπορικό όργανο dPCR βασισμένο σε τσιπ.Το 2009, η Life Technologies παρουσίασε τα συστήματα OpenArray και QuantStudio 12K Flex dPCR.Το 2013, η Life Technologies κυκλοφόρησε το σύστημα QuantStudio 3DdPCR, το οποίο χρησιμοποιεί τεχνολογία μικρορευστωδών τσιπ υψηλής πυκνότητας νανοκλίμακας για την ομοιόμορφη κατανομή των δειγμάτων σε 20.000 μεμονωμένα κύτταρα.στο πηγάδι της αντίδρασης.
Το 2011, η Bio-Rad κυκλοφόρησε το όργανο QX100 dPCR που βασίζεται σε σταγονίδια, το οποίο χρησιμοποιεί τεχνολογία νερού σε λάδι για να κατανέμει ομοιόμορφα το δείγμα σε 20.000 σταγονίδια-νερό-σε-έλαιο και χρησιμοποιεί έναν αναλυτή σταγονιδίων για την ανάλυση των σταγονιδίων.Το 2012, η RainDance κυκλοφόρησε το όργανο RainDrop dPCR, που οδηγείται από αέριο υψηλής πίεσης, για να διαιρέσει κάθε τυπικό σύστημα αντίδρασης σε ένα γαλάκτωμα αντίδρασης που περιέχει 1 εκατομμύριο έως 10 εκατομμύρια μικροσταγονίδια επιπέδου picoliter.
Μέχρι στιγμής, η ψηφιακή PCR έχει σχηματίσει δύο μεγάλες φατρίες, τύπου chip και τύπου droplet.Ανεξάρτητα από το είδος της ψηφιακής PCR, οι βασικές αρχές της είναι η περιοριστική αραίωση, η PCR τελικού σημείου και η διανομή Poisson.Το τυπικό σύστημα αντίδρασης PCR που περιέχει εκμαγεία νουκλεϊκού οξέος χωρίζεται ομοιόμορφα σε δεκάδες χιλιάδες αντιδράσεις PCR, οι οποίες κατανέμονται σε τσιπ ή μικροσταγονίδια, έτσι ώστε κάθε αντίδραση να περιέχει όσο το δυνατόν περισσότερο ένα μόριο μήτρας και να εκτελείται μια αντίδραση PCR μήτρας ενός μορίου.Με την ανάγνωση του φθορισμού μετράται η παρουσία ή η απουσία του σήματος και η απόλυτη ποσοτικοποίηση πραγματοποιείται μετά τη βαθμονόμηση της στατιστικής κατανομής Poisson.
Τα ακόλουθα είναι τα χαρακτηριστικά πολλών ψηφιακών πλατφορμών PCR που έχω χρησιμοποιήσει:
1. Bio-Rad QX200 droplet digital PCR Bio-RadΤο QX200 είναι μια πολύ κλασική ψηφιακή πλατφόρμα PCR, η βασική διαδικασία ανίχνευσης: 20.000 δείγματα δημιουργούνται από τη γεννήτρια σταγονιδίων.Η λειτουργία είναι πιο περίπλοκη και ο κίνδυνος ρύπανσης μέτριος.
Xinyi TD1 micro-droplet ψηφιακή PCRΤο Xinyi TD1 είναι μια εγχώρια ψηφιακή πλατφόρμα PCR, η βασική διαδικασία ανίχνευσης: δημιουργήστε 30.000-50.000 σταγονίδια νερού σε λάδι μέσω μιας γεννήτριας σταγονιδίων, ενισχύστε σε ένα κοινό όργανο PCR και, τέλος, περάστε Η συσκευή ανάγνωσης σταγονιδίων διαβάζει το φθορίζον σήμα κάθε σταγονιδίου.Τόσο η δημιουργία σταγονιδίων όσο και η ανάγνωση σε αυτήν την πλατφόρμα εκτελούνται σε ένα αποκλειστικό τσιπ με χαμηλό κίνδυνο μόλυνσης.
STILLA Naica micro-droplet chip ψηφιακό PCRΤο STILLA Naica είναι μια σχετικά νέα ψηφιακή πλατφόρμα PCR.Η βασική διαδικασία ανίχνευσης είναι: προσθέστε το διάλυμα αντίδρασης στο τσιπ, βάλτε το τσιπ στο σύστημα δημιουργίας και ενίσχυσης μικροσταγονιδίων και δημιουργήστε 30.000 μικροσταγονίδια.Απλώνεται στο τσιπ και η ενίσχυση PCR ολοκληρώνεται στο τσιπ.Στη συνέχεια, το ενισχυμένο τσιπ μεταφέρεται στο σύστημα ανάλυσης ανάγνωσης μικροσταγονιδίων και διαβάζεται το φθορίζον σήμα τραβώντας φωτογραφίες.Δεδομένου ότι η όλη διαδικασία λαμβάνει χώρα σε ένα κλειστό τσιπ, ο κίνδυνος μόλυνσης είναι χαμηλός.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D chip ψηφιακό PCR
Το ThermoFisher QuantStudio 3D είναι μια άλλη κλασική πλατφόρμα ψηφιακής PCR που βασίζεται σε τσιπ.Η βασική του διαδικασία ανίχνευσης είναι: προσθέστε το διάλυμα αντίδρασης στον διανομέα και απλώστε το διάλυμα αντίδρασης ομοιόμορφα στο τσιπ με 20.000 μικροβυθίσματα μέσω του διανομέα., τοποθετήστε το τσιπ στο μηχάνημα PCR για ενίσχυση και, τέλος, τοποθετήστε το τσιπ στη συσκευή ανάγνωσης και τραβήξτε μια φωτογραφία για να διαβάσετε το φθορίζον σήμα.Η λειτουργία είναι σχετικά περίπλοκη και η όλη διαδικασία πραγματοποιείται σε κλειστό τσιπ και ο κίνδυνος μόλυνσης είναι χαμηλός.
5. JN MEDSYS Clarity chip Digital PCR
Το JN MEDSYS Clarity είναι μια σχετικά νέα ψηφιακή πλατφόρμα PCR τύπου chip.Η βασική του διαδικασία ανίχνευσης είναι: προσθέστε το διάλυμα αντίδρασης στον εφαρμοστή και απλώστε το διάλυμα αντίδρασης ομοιόμορφα σε 10.000 σωλήνες PCR στερεωμένους στο σωλήνα PCR μέσω του απλικατέρ.Στο μικροπορώδες τσιπ, το διάλυμα αντίδρασης εισέρχεται στο τσιπ μέσω τριχοειδούς δράσης και ο σωλήνας PCR με το τσιπ τοποθετείται στη μηχανή PCR για ενίσχυση και τέλος το τσιπ τοποθετείται στον αναγνώστη για να διαβάσει το φθορίζον σήμα τραβώντας μια φωτογραφία.Η επέμβαση είναι πιο περίπλοκη.Ο κίνδυνος μόλυνσης είναι χαμηλός.
Οι παράμετροι κάθε ψηφιακής πλατφόρμας PCR συνοψίζονται ως εξής:
Οι δείκτες αξιολόγησης της ψηφιακής πλατφόρμας PCR είναι: ο αριθμός των διαχωρισμένων μονάδων, ο αριθμός των καναλιών φθορισμού, η πολυπλοκότητα λειτουργίας και ο κίνδυνος μόλυνσης.Αλλά το πιο σημαντικό πράγμα είναι η ακρίβεια ανίχνευσης.Ένας τρόπος αξιολόγησης των ψηφιακών πλατφορμών PCR είναι η χρήση πολλαπλών ψηφιακών πλατφορμών PCR για επαλήθευση μεταξύ τους και ένας άλλος τρόπος είναι η χρήση τυπικών ουσιών με ακριβείς τιμές.
Πλεονεκτήματα της dPCR
1.Επίτευξη απόλυτης ποσοτικοποίησης
2.Υψηλότερη ευαισθησία και ειδικότητα
3.Μπορεί να ανιχνεύσει δείγματα χαμηλού αντιγράφου
Μειονεκτήματα της dPCR1. Ακριβός εξοπλισμός και αντιδραστήρια 2. Πολύπλοκη λειτουργία και μεγάλος χρόνος ανίχνευσης 3. στενό εύρος ανίχνευσης
Προς το παρόν, οι τρεις γενιές της τεχνολογίας PCR έχουν τα δικά τους πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα και η καθεμία έχει τα δικά της πεδία εφαρμογής και δεν είναι μια σχέση η μία γενιά να αντικαθιστά την άλλη.Η συνεχής πρόοδος της τεχνολογίας έχει δώσει νέα ζωτικότητα στην τεχνολογία PCR, επιτρέποντάς της να ξεκλειδώνει τη μία κατεύθυνση εφαρμογής μετά την άλλη, καθιστώντας την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων πιο βολική και ακριβή.
Πηγή: Ο Δρ Γιουάν σας πηγαίνει για δοκιμή
Προτεινόμενα προϊόντα:
Ώρα δημοσίευσης: Νοε-18-2022
