1. Ονομάστε τις συναρτήσεις περισσότερων από 5 RNA;
Μεταφορά RNA tRNA Αμινοξύ μεταφοράς RNA ριβοσώματος rRNA Το ριβόσωμα αποτελεί πρότυπο σύνθεσης πρωτεϊνών mRNA αγγελιοφόρου RNA Ετερογενές πυρηνικό RNA hnRNA Πρόδρομος ώριμου mRNA μικρού πυρηνικού RNA snRNA Συμμετέχεται στη μάτιση hnRNA Μικρό κυτταροπλασματικό RNA scRNA/7macallosco proteinums Αντιπληροφοριακό RNA anRNA/micRNA Ρυθμίζει την έκφραση γονιδίου Ribozyme RNA Ενζυμικά ενεργό RNA
2. Ποια είναι η κύρια διαφορά μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών προαγωγέων;
Προκαρυωτικό TTGACA --- TATAAT------Τόπος έναρξης-35 -10 Ευκαρυωτικός ενισχυτής---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Θέση Έναρξης-110 -70 -25
3. Ποιες είναι οι κύριες πτυχές της τεχνητής κατασκευής φυσικών πλασμιδίων;
Τα φυσικά πλασμίδια έχουν συχνά ελαττώματα, επομένως δεν είναι κατάλληλα για χρήση ως φορείς για τη γενετική μηχανική, και πρέπει να τροποποιηθούν και να κατασκευαστούν: α.Προσθέστε κατάλληλα γονίδια δείκτη επιλογής, όπως δύο ή περισσότερα, τα οποία είναι εύχρηστα για επιλογή, συνήθως αντιβιοτικά γονίδια.σι.Αυξήστε ή μειώστε τις κατάλληλες θέσεις κοπής ενζύμων για να διευκολύνετε τον ανασυνδυασμό.ντο.Μειώστε το μήκος, κόψτε τα περιττά θραύσματα, βελτιώστε την απόδοση εισαγωγής και αυξήστε την ικανότητα φόρτωσης.ρε.Αλλάξτε το αντίγραφο, από στενό σε χαλαρό, από λιγότερα αντίγραφα σε περισσότερα αντίγραφα.μι.Προσθέστε ειδικά γενετικά στοιχεία σύμφωνα με τις ειδικές απαιτήσεις της γενετικής μηχανικής
4. Δώστε ένα παράδειγμα μεθόδου διαφορικής διαλογής cDNA ειδικού για ιστούς;
Παρασκευάζονται δύο πληθυσμοί κυττάρων, το γονίδιο στόχος εκφράζεται ή εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό σε ένα από τα κύτταρα και το γονίδιο στόχος δεν εκφράζεται ή εκφράζεται ελάχιστα στο άλλο κύτταρο, και στη συνέχεια το γονίδιο στόχος βρίσκεται με υβριδισμό και σύγκριση.Για παράδειγμα, κατά την εμφάνιση και την ανάπτυξη όγκων, τα καρκινικά κύτταρα θα παρουσιάζουν mRNAs με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης από τα φυσιολογικά κύτταρα.Επομένως, τα γονίδια που σχετίζονται με τον όγκο μπορούν να εξεταστούν με διαφορικό υβριδισμό.Η μέθοδος επαγωγής μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τη διαλογή των γονιδίων των οποίων η έκφραση προκαλείται.
5. Δημιουργία και διαλογή κυτταρικών σειρών υβριδώματος;
Κύτταρα Β σπλήνας + κύτταρα μυελώματος, προσθέστε πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) για την προώθηση της κυτταρικής σύντηξης και τα κύτταρα σύντηξης του σπληνικού Β-μυελώματος που αναπτύχθηκαν σε μέσο HAT (που περιέχει υποξανθίνη, αμινοπτερίνη, Τ) συνεχίζουν να διαστέλλονται και να θρέφουν.Η κυτταρική σύντηξη περιέχει: κύτταρα σύντηξης σπλήνας-σπληνός: δεν μπορούν να αναπτυχθούν, τα κύτταρα σπλήνας δεν μπορούν να καλλιεργηθούν in vitro.Κύτταρα σύντηξης οστού-οστού: δεν μπορούν να χρησιμοποιήσουν υποξανθίνη, αλλά μπορούν να συνθέσουν πουρίνη μέσω της δεύτερης οδού χρησιμοποιώντας αναγωγάση φολικού οξέος.Η αμινοπτερίνη αναστέλλει την αναγωγάση του φολικού οξέος και έτσι δεν μπορεί να αναπτυχθεί.Κύτταρα σύντηξης οστού-σπληνός: μπορούν να αναπτυχθούν σε HAT, τα κύτταρα σπλήνας μπορούν να χρησιμοποιήσουν υποξανθίνη και τα κύτταρα των οστών παρέχουν λειτουργία κυτταρικής διαίρεσης.
6. Ποια είναι η αρχή και η μέθοδος προσδιορισμού της πρωτογενούς δομής του DNA με τη μέθοδο τερματικού τερματισμού διδεοξυ (μέθοδος Sanger);
Η αρχή είναι να χρησιμοποιηθεί ένας τερματιστής νουκλεοτιδικής αλυσίδας—2,,3,-διδεοξυνουκλεοτίδιο για να τερματιστεί η επέκταση του DNA.Δεδομένου ότι δεν έχει το 3-ΟΗ που απαιτείται για το σχηματισμό δεσμών 3/5/φωσφοδιεστέρα, αφού ενσωματωθεί στην αλυσίδα DNA, η αλυσίδα DNA δεν μπορεί να επεκταθεί περαιτέρω.Σύμφωνα με την αρχή του ζευγαρώματος βάσεων, όποτε η DNA πολυμεράση χρειάζεται dNMP για να συμμετάσχει στην κανονικά εκτεταμένη αλυσίδα DNA, υπάρχουν δύο δυνατότητες, η μία είναι η συμμετοχή στο ddNTP, που έχει ως αποτέλεσμα τον τερματισμό της επέκτασης της δεοξυνουκλεοτιδικής αλυσίδας.το άλλο είναι να συμμετέχουμε στο dNTP, έτσι ώστε η αλυσίδα του DNA να συνεχίσει να εκτείνεται μέχρι να ενσωματωθεί το επόμενο ddNTP.Σύμφωνα με αυτή τη μέθοδο, μπορεί να ληφθεί μια ομάδα θραυσμάτων DNA διαφορετικών μηκών που καταλήγουν σε ddNTP.Η μέθοδος είναι να χωριστεί σε τέσσερις ομάδες αντίστοιχα ddAMP, ddGMP, ddCMP και ddTMP.Μετά την αντίδραση, η ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου μπορεί να διαβάσει την αλληλουχία DNA σύμφωνα με τις ζώνες κολύμβησης.
7. Ποια είναι η θετική επίδραση ρύθμισης της πρωτεΐνης ενεργοποιητή (CAP) στη μεταγραφή;
Πρωτεΐνη υποδοχέα κυκλικού αδενυλικού (cAMP) CRP (cAMP receptor protein), το σύμπλοκο που σχηματίζεται από τον συνδυασμό cAMP και CRP ονομάζεται CAP (cAMPactivated protein).Όταν το E. coli αναπτύσσεται σε ένα μέσο χωρίς γλυκόζη, η σύνθεση του CAP αυξάνεται και το CAP έχει τη λειτουργία της ενεργοποίησης προαγωγέων όπως η λακτόζη (Lac).Ορισμένοι προαγωγείς που εξαρτώνται από την CRP δεν διαθέτουν το χαρακτηριστικό γνώρισμα αλληλουχίας περιοχής -35 (TTGACA) που έχουν οι κοινοί προαγωγείς.Επομένως, είναι δύσκολο για την RNA πολυμεράση να συνδεθεί σε αυτήν.Η παρουσία CAP (λειτουργία): μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη σταθερά δέσμευσης του ενζύμου και του προαγωγέα.Δείχνει κυρίως τις ακόλουθες δύο πτυχές: ① CAP βοηθά το μόριο του ενζύμου να προσανατολιστεί σωστά αλλάζοντας τη διαμόρφωση του προαγωγέα και την αλληλεπίδραση με το ένζυμο, έτσι ώστε να συνδυαστεί με την περιοχή -10 και να παίξει το ρόλο της αντικατάστασης της λειτουργίας της περιοχής -35.Το ②CAP μπορεί επίσης να αναστείλει τη σύνδεση της RNA πολυμεράσης σε άλλες θέσεις στο DNA, αυξάνοντας έτσι την πιθανότητα δέσμευσης στον ειδικό προαγωγέα της.
8. Ποια βήματα περιλαμβάνονται συνήθως σε ένα τυπικό πείραμα ανασυνδυασμού DNA;
ένα.Εξάγετε το γονίδιο στόχο (ή το εξωγενές γονίδιο) του οργανισμού δότη και συνδέστε το ενζυματικά με ένα άλλο μόριο DNA (φορέας κλωνοποίησης) για να σχηματίσετε ένα νέο μόριο ανασυνδυασμένου DNA.σι.Μεταφέρετε το μόριο ανασυνδυασμένου DNA στο κύτταρο δέκτη και αντιγράψτε το και διατηρήστε το στο κύτταρο δέκτη.Αυτή η διαδικασία ονομάζεται μετασχηματισμός.ντο.Εξετάστε και εντοπίστε εκείνα τα κύτταρα-δέκτες που έχουν απορροφήσει το ανασυνδυασμένο DNA.ρε.Μαζική καλλιέργεια των κυττάρων που περιέχουν το ανασυνδυασμένο DNA για να ανιχνευθεί εάν το γονίδιο ξένου βοηθήματος εκφράζεται.
9. Κατασκευή βιβλιοθήκης γονιδίων Δίνονται τρεις μέθοδοι διαλογής ανασυνδυασμένων και η διαδικασία περιγράφεται εν συντομία.
Έλεγχος αντοχής στα αντιβιοτικά, αδρανοποίηση αντίστασης κατά την εισαγωγή, διαλογή μπλε-λευκής κηλίδας ή εξέταση PCR, διαφορικός έλεγχος, ανιχνευτής DNA Οι περισσότεροι φορείς κλωνοποίησης φέρουν γονίδια ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά (αντι-αμπικιλίνη, τετρακυκλίνη).Όταν το πλασμίδιο μεταφερθεί σε Escherichia coli, τα βακτήρια θα αποκτήσουν αντίσταση και αυτά που δεν μεταφέρονται δεν θα έχουν αντίσταση.Δεν μπορεί όμως να διακρίνει αν έχει αναδιοργανωθεί ή όχι.Σε έναν φορέα που περιέχει δύο γονίδια αντίστασης, εάν ένα ξένο θραύσμα DNA εισαχθεί σε ένα από τα γονίδια και προκαλέσει την αδρανοποίηση του γονιδίου, μπορούν να χρησιμοποιηθούν δύο μάρτυρες πλακών που περιέχουν διαφορετικά φάρμακα για τη διαλογή για θετικούς ανασυνδυασμούς.Για παράδειγμα, το πλασμίδιο pUC περιέχει το γονίδιο LacZ (που κωδικοποιεί τη β-γαλακτοσιδάση), το οποίο μπορεί να αποσυνθέσει το χρωμογόνο υπόστρωμα X-gal (5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολο-β-D-γαλακτοσίδη) για να παράγει μπλε, μετατρέποντας έτσι το στέλεχος μπλε.Όταν εισάγεται το ξένο DNA, το γονίδιο LacZ δεν μπορεί να εκφραστεί και το στέλεχος είναι λευκό, έτσι ώστε να γίνει διαλογή των ανασυνδυασμένων βακτηρίων.
10. Εξηγήστε τη βασική διαδικασία λήψης διαγονιδιακών ζώων μέσω εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων;
Τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (ES) είναι εμβρυϊκά κύτταρα κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, τα οποία μπορούν να καλλιεργηθούν και να πολλαπλασιαστούν τεχνητά και να έχουν τη λειτουργία της διαφοροποίησης σε άλλους τύπους κυττάρων.Καλλιέργεια κυττάρων ES: Η εσωτερική κυτταρική μάζα της βλαστοκύστης απομονώνεται και καλλιεργείται.Όταν το ES καλλιεργείται σε ένα στρώμα χωρίς τροφοδότη, θα διαφοροποιηθεί σε διάφορα λειτουργικά κύτταρα όπως μυϊκά κύτταρα και Ν κύτταρα.Όταν καλλιεργείται σε μέσο που περιέχει ινοβλάστες, το ES θα διατηρήσει τη λειτουργία διαφοροποίησης.Το ES μπορεί να υποστεί γενετική χειραγώγηση και η συνάρτηση διαφοροποίησής του μπορεί να ενσωματωθεί χωρίς να επηρεαστεί η λειτουργία διαφοροποίησής του, η οποία λύνει το πρόβλημα της τυχαίας ολοκλήρωσης.Εισάγετε εξωγενή γονίδια σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα, στη συνέχεια εμφυτεύστε στη μήτρα εγκύων θηλυκών ποντικών, εξελίξτε σε νεογνά και διασταυρώστε για να αποκτήσετε ομόζυγα ποντίκια.