Συγγραφείς: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Μονάδα: Νοσοκομείο Jiaozhou, Νοσοκομείο Dongfang που συνδέεται με το Πανεπιστήμιο Tongji

Επί του παρόντος, ο κύριος τύπος δείγματος για την ανίχνευση νουκλεϊκού οξέος παθογόνου του αναπνευστικού είναι το λαιμόκοκκο.Υπάρχουν πολλά είδη διαλυμάτων συντήρησης δειγμάτων που χρησιμοποιούνται συνήθως, τα οποία πρέπει να διατηρηθούν στο ψυγείο ή να καταψυχθούν για μεταφορά και αποθήκευση.Είναι δύσκολο να ελεγχθεί ολόκληρη η διαδικασία της χαμηλής θερμοκρασίας κατά τη διαδικασία συλλογής και μεταφοράς και είναι δύσκολο να εξασφαλιστεί ο ποιοτικός έλεγχος πριν από τη δοκιμή δειγμάτων^[1-2].

Η RNase (RNase) είναι μια ενδονουκλεάση που υδρολύει το RNA, αποκόπτοντας κυρίως τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς μεταξύ των νουκλεοτιδίων.Το μόριο RNase είναι πολύ σταθερό, υπάρχουν δισουλφιδικοί δεσμοί στη δομή και η δραστηριότητά του δεν απαιτεί την παρουσία δισθενών κατιόντων, επομένως η RNase δεν μετουσιώνεται εύκολα και είναι εύκολο να μετουσιωθεί ακόμη και μετά από υψηλή θερμοκρασία ή τη χρήση μετουσιωτών.Οι RNases χωρίζονται σε ενδογενείς και εξωγενείς.Οι ενδογενείς RNases μπορούν να απελευθερωθούν ταυτόχρονα όταν τα κύτταρα διαρρηγνύονται.Επομένως, η εξάλειψη του ρόλου των ενδογενών RNases είναι ένα πολύ κρίσιμο βήμα στη διαδικασία εξαγωγής RNA.Οι εξωγενείς RNases είναι ευρέως κατανεμημένες.Οι RNases υπάρχουν στον αέρα, το ανθρώπινο δέρμα, τα μαλλιά και το σάλιο, που είναι σημαντικοί λόγοι για την εύκολη αποικοδόμηση του RNA^[3].

Ερώτημα δεδομένων

Το CANS-CL02-A009 «Εφαρμογή κατευθυντήριων γραμμών για τη διαπίστευση της ποιότητας και της ικανότητας ιατρικών εργαστηρίων στον τομέα της μοριακής διάγνωσης» στις τεχνικές απαιτήσεις προτείνει τη διαμόρφωση των κατάλληλων προτύπων ποιότητας του νερού σύμφωνα με την εφαρμογή.Στεγανά δοχεία μιας χρήσης:

RNase/Ταξινόμηση

(1) RNase A

Η ριβονουκλεάση Α (RNase A), που προέρχεται από βόειο πάγκρεας, είναι μια ενδοριβονουκλεάση που μπορεί να επιτεθεί ειδικά στο 3' άκρο των υπολειμμάτων πυριμιδίνης στο RNA, κόβοντας την κυτοσίνη ή την ουρακίλη που σχηματίζονται από παρακείμενα νουκλεοτίδια.Φωσφοδιεστερικός δεσμός, το τελικό προϊόν της αντίδρασης είναι ένα νουκλεοτίδιο πυριμιδίνης 3' και ένα ολιγονουκλεοτίδιο με ένα νουκλεοτίδιο πυριμιδίνης 3' στο τέλος.

(2) RNase T1

Η ριβονουκλεάση T1 (RNase T1) προέρχεται από το Aspergillus orjzae, δρα ειδικά στο 3'-τελικό φωσφορικό άλας της γουανίνης και η θέση διάσπασης είναι μεταξύ του 3' φωσφορικού της γουανίνης και του 5' υδροξυλίου των παρακείμενων νουκλεοτιδίων.Το τελικό προϊόν της αντίδρασης είναι 3'γουανυλικό οξύ και θραύσματα ολιγονουκλεοτιδίων με 3'γουανυλικό οξύ στο τέλος.

(3) RNase H

Η ριβονουκλεάση Η (RNase H) ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά από ιστό θύμου μόσχου και το γονίδιο που κωδικοποιεί έχει κλωνοποιηθεί σε Escherichia coli.Μπορεί να αποικοδομήσει ειδικά το DNA: κλώνους RNA σε υβριδικά διπλά RNA, με αποτέλεσμα ολιγονουκλεοτίδια και μονονουκλεοτίδια με άκρα 3'-ΟΗ και 5'-μονοφωσφορικά, δεν μπορεί να αποικοδομήσει μονόκλωνο ή δίκλωνο DNA ή RNA.

RNase

Λειτουργία και χρήση

Η ριβονουκλεάση μπορεί να καταλύσει την αποικοδόμηση του ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA) και μπορεί να συντεθεί τεχνητά.Η φαρμακευτική αλοιφή χρησιμοποιείται τοπικά για τη θεραπεία τραύματος και πόνου στις αρθρώσεις.Σύμφωνα με αναφορές, η ριβονουκλεάση μπορεί να αλλάξει τον μεταβολισμό των κυττάρων του ξενιστή, να αναστείλει τη σύνθεση του ιού, να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό του ιού της γρίπης in vitro και να αναστείλει τον σχηματισμό της δαμαλίτιδας και του ιού του έρπητα σε έμβρυα κοτόπουλου.Κλινική χρήση ριβονουκλεάσης ημερήσια ενδομυϊκή ένεση 180 mg, ευεργετική για τη θεραπεία της επιδημικής εγκεφαλίτιδας, η ριβονουκλεάση μπορεί να καταλύσει την αποδόμηση του ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA) και μπορεί τώρα να συντεθεί τεχνητά.Η φαρμακευτική αλοιφή χρησιμοποιείται τοπικά για τη θεραπεία τραύματος και πόνου στις αρθρώσεις.Σύμφωνα με αναφορές, η ριβονουκλεάση μπορεί να αλλάξει τον μεταβολισμό των κυττάρων του ξενιστή, να αναστείλει τη σύνθεση του ιού, να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό του ιού της γρίπης in vitro και να αναστείλει τον σχηματισμό της δαμαλίτιδας και του ιού του έρπητα σε έμβρυα κοτόπουλου.Η κλινική χρήση ριβονουκλεάσης ημερήσια ενδομυϊκή ένεση 180 mg είναι ευεργετική για τη θεραπεία της επιδημικής εγκεφαλίτιδας.

RNase

Ορισμός αναστολέα

Ορισμός της μονάδας αναστολέα RNase: Η ποσότητα του ενζύμου που απαιτείται για την αναστολή του 50% της δραστηριότητας της 5ng RNase A είναι μία μονάδα.

Πώς λειτουργούν οι αναστολείς RNase

Ισοθειοκυανική γουανιδίνη:

Η ισοθειοκυανική γουανιδίνη είναι μια οργανική ένωση με μοριακό τύπο C2H6N4S.Χρησιμοποιείται κυρίως στη βιολογική ιατρική, χημικά αντιδραστήρια κ.λπ. Η ισοθειοκυανική γουανιδίνη είναι ένας παράγοντας λύσης πρωτεΐνης και χρησιμοποιείται συχνά ως το κύριο συστατικό του διαλύματος λύσης σε μοριακά διαγνωστικά αντιδραστήρια.Μπορεί να λύσει τον ιστό, να καταστρέψει τη δομή των κυττάρων και να διαχωρίσει το νουκλεϊκό οξύ από την νουκλεοπρωτεΐνη και έχει ισχυρή μετουσίωση σε RNase.Είναι ο πιο αποτελεσματικός αναστολέας RNase επί του παρόντος.

Το TRIZol είναι ένα νέο αντιδραστήριο εξαγωγής ολικού RNA που μπορεί να εξαγάγει απευθείας ολικό RNA από κύτταρα ή ιστούς.Περιέχει ουσίες όπως η φαινόλη και η ισοθειοκυανική γουανιδίνη, οι οποίες μπορούν να διαταράξουν γρήγορα τα κύτταρα και να αναστείλουν τις νουκλεάσες που απελευθερώνονται από τα κύτταρα.

(Ωστόσο, η ισοθειοκυανική γουανιδίνη είναι επικίνδυνη για την υγεία των εργαστηριακών ερευνητών.)

RNasin:

Όξινη γλυκοπρωτεΐνη που εκχυλίζεται από ήπαρ αρουραίου ή ανθρώπινο βλαστόδερμα.Η Rnasin είναι ένας μη ανταγωνιστικός αναστολέας της RNase, ο οποίος μπορεί να συνδεθεί με διάφορες RNases για να τις απενεργοποιήσει.

(Περισσότερες λεπτομέρειες: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hυψηλή θερμοκρασία:

Η υψηλή θερμοκρασία είναι επίσης ένα κοινό μέσο μετουσίωσης των πρωτεϊνών.

Πυροανθρακικό διαιθυλεστέρα (DEPC):

Το DEPC είναι ένας ισχυρός αλλά ατελής αναστολέας RNase, ο οποίος μπορεί να αναστείλει τη δραστηριότητα της RNase συνδυάζοντας με τον δακτύλιο αμινοξέος ιμιδαζόλης της ενεργής ομάδας RNase για να μετουσιώσει τις πρωτεΐνες.

Σύμπλεγμα ριβονουκλεοζίτη βαναδυλίου:

Ένα σύμπλεγμα που σχηματίζεται από ιόντα οξειδίου του βαναδίου και νουκλεοζίτες, το οποίο συνδέεται με τη RNase με τη μορφή μεταβατικών ουσιών, οι οποίες μπορούν σχεδόν πλήρως να αναστείλουν τη δραστηριότητα της RNase

άλλα:

Το SDS, η ουρία, η γη διατόμων κ.λπ. έχουν επίσης μια ορισμένη ανασταλτική δράση στην RNase.

Κριτικές εμπειρογνωμόνων

Li Yujie Αρχιτεχνικός

Διευθυντής Εργαστηριακού Τμήματος, Νοσοκομείο Jiaozhou, Νοσοκομείο Dongfang που συνδέεται με το Πανεπιστήμιο Tongji

Προκειμένου να αποφευχθεί η βιοαποδόμηση της εξωγενούς RNase, μάσκες, γάντια και καπέλα θα πρέπει να φοριούνται και να αντικαθίστανται συχνά κατά τη διαδικασία εξαγωγής RNA.Όλα τα γυάλινα σκεύη πρέπει να ψήνονται σε φούρνο στεγνώματος στους 200°C για περισσότερες από 2 ώρες.Τα υλικά που χρησιμοποιούνται για το ψήσιμο, όπως το πλαστικό, πρέπει να υποστούν επεξεργασία με νερό DEPC και στη συνέχεια να πλυθούν με απεσταγμένο νερό.Τα αντιδραστήρια ή οι συσκευές που χρησιμοποιούνται για την εκχύλιση, τη διατήρηση και την ταυτοποίηση του RNA θα πρέπει να είναι αφιερωμένα στο RNA και θα πρέπει να δημιουργηθεί μια ανεξάρτητη περιοχή λειτουργίας RNA.

βιβλιογραφικές αναφορές:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Βακτήρια και ιοί στο ρινοφάρυγγα αμέσως πριν από την εμφάνιση οξειών λοιμώξεων του κατώτερου αναπνευστικού σε ιθαγενή παιδιά της Αυστραλίας[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018,37 (9): 1785-1794.

[2] Κλάδος Ελέγχου Νοσοκομειακών Λοιμώξεων της Κινεζικής Εταιρείας Προληπτικής Ιατρικής.Οδηγίες για τη συλλογή και επιθεώρηση κλινικών μικροβιακών δειγμάτων [J].Chinese Journal of Hospital Infection, 2018(20):3192-3200.

[3] «Κλινική δοκιμή Τόμος δοκιμών για δέκα χιλιάδες γιατί μοριακής βιολογίας»