Η επαλήθευση της απόδοσης των εκκινητών και των ανιχνευτών στο πρώιμο στάδιο των αντιδραστηρίων PCR και ο καθορισμός των καταλληλότερων συνθηκών αντίδρασης είναι οι προϋποθέσεις για να διασφαλιστεί η ομαλή πρόοδος των επίσημων πειραμάτων.
Πώς πρέπει λοιπόν να επιβεβαιώσουμε τον ανιχνευτή εκκινητή στο αρχικό στάδιο;
Οι κύριοι δείκτες είναι η γραμμή βάσης, η καμπύλη ενίσχυσης, η τιμή ct, η απόδοση ενίσχυσης, η ανίχνευση δείγματος χαμηλής συγκέντρωσης, το CV κ.λπ.
Βασική γραμμή
Η βασική γραμμή είναι η οριζόντια γραμμή στην καμπύλη ενίσχυσης PCR.Στους πρώτους κύκλους της αντίδρασης ενίσχυσης PCR, το σήμα φθορισμού δεν αλλάζει πολύ και σχηματίζει μια ευθεία γραμμή.Αυτή η ευθεία είναι η βασική γραμμή.
Κατά τη διαλογή των ανιχνευτών εκκινητών PCR, προσέξτε εάν η γραμμή βάσης είναι επίπεδο.Η καθαρότητα της συγκέντρωσης του ανιχνευτή εκκινητή θα επηρεάσει τη βασική γραμμή, όπως προκαλώντας αύξηση ή πτώση της γραμμής βάσης.Η βασική γραμμή είναι επίσης ένας πολύ διαισθητικός δείκτης.
Καμπύλη ενίσχυσης
Ένας άλλος διαισθητικός δείκτης είναι το σχήμα της καμπύλης ενίσχυσης.Είναι καλύτερο να έχετε μια καμπύλη σχήματος S για να αποφύγετε τη δευτερεύουσα ενίσχυση ή άλλες μη φυσιολογικές καμπύλες ενίσχυσης.
Τιμή Ct
Ο αριθμός των κύκλων που αντιστοιχεί στο σημείο καμπής από τη γραμμή βάσης στην εκθετική αύξηση είναι η τιμή Ct.
Για το ίδιο δείγμα, διαφορετικοί ανιχνευτές εκκινητών καταλήγουν σε διαφορετικές καμπύλες ενίσχυσης και η αντίστοιχη τιμή Ct θα επηρεαστεί από την απόδοση ενίσχυσης και τον βαθμό παρεμβολής.Θεωρητικά, όσο μικρότερη είναι η τιμή Ct του ανιχνευτή εκκινητή που επιλέξουμε, τόσο το καλύτερο.
Αποδοτικότητα Ενίσχυσης
Μία από τις πιο αξιόπιστες και σταθερές μεθόδους για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της ενίσχυσης PCR είναι η τυπική καμπύλη, η οποία είναι επίσης ευρέως αναγνωρισμένη από τους ερευνητές.Η μέθοδος περιλαμβάνει τη δημιουργία μιας σειράς δειγμάτων για τον έλεγχο του σχετικού αριθμού προτύπων-στόχων.Αυτά τα δείγματα γίνονται συνήθως με σειριακές αραιώσεις συμπυκνωμένων μητρικών διαλυμάτων, η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη είναι η 10πλάσια αραίωση.Χρησιμοποιώντας μια σειρά αραιωμένων δειγμάτων, χρησιμοποιώντας τυπικό πρόγραμμα qPCR για ενίσχυση για να λάβετε την τιμή Cq και τέλος σχεδιάστε μια τυπική καμπύλη σύμφωνα με τη συγκέντρωση κάθε δείγματος και την αντίστοιχη τιμή Cq για να λάβετε τη γραμμική εξίσωση Cq= -klgX0+b και την απόδοση ενίσχυσης E=10(-1 /k)-1.Όταν χρησιμοποιείται qPCR για ποσοτική ανάλυση, η απόδοση ενίσχυσης απαιτείται να είναι στην περιοχή 90%-110% (3,6>k>3,1).
Ανίχνευση δειγμάτων χαμηλής συγκέντρωσης
Όταν η συγκέντρωση του δείγματος είναι χαμηλή, οι ρυθμοί ανίχνευσης διαφορετικών ανιχνευτών εκκινητών είναι διαφορετικοί.Επιλέγουμε 20 δείγματα χαμηλής συγκέντρωσης για αναπαραγωγή και το σύστημα εκκινητή-ανιχνευτή με τον υψηλότερο ρυθμό ανίχνευσης είναι το καλύτερο.
Συντελεστής Διακύμανσης (CV)
10 διπλά δείγματα μπορούν να ανιχνευθούν με διαφορετικούς ανιχνευτές εκκινητών σύμφωνα με το πρότυπο γραμμής του αντιδραστηρίου για ανίχνευση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος.
Ποσοτικά αντιδραστήρια:
Ακρίβεια
Η ακρίβεια σε μία παρτίδα πρέπει να πληροί: ο συντελεστής διακύμανσης (CV,%) της λογαριθμικής τιμής της συγκέντρωσης δοκιμής είναι ≤5%.Όταν η συγκέντρωση του δείγματος είναι χαμηλή, ο συντελεστής διακύμανσης (CV,%) του λογαρίθμου της συγκέντρωσης ανίχνευσης είναι ≤10%
Ποιοτικά αντιδραστήρια:
Ακρίβεια
Η ακρίβεια σε μία παρτίδα πρέπει να πληροί:
(1) Συντελεστής διακύμανσης της τιμής Ct (CV,%) ≤5%
Το ίδιο δείγμα ελέγχεται παράλληλα για 10 φορές και τα αποτελέσματα της δοκιμής πρέπει να είναι συνεπή
Ώρα δημοσίευσης: Σεπ-18-2021
