Πιστεύω ότι όλοι θα αντιμετωπίζουν πάντα τέτοια ή τέτοια προβλήματα όταν κάνουν αντιδράσεις PCR, αλλά τα περισσότερα από αυτά μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο κύρια προβλήματα:

Πολύ μικρή ενίσχυση του προτύπου γονιδίου (ενίσχυση).
Υπερβολικά μεγάλη ενίσχυση γονιδίου μη στόχου.
Η χρήση πρόσθετων είναι μία από τις κοινές στρατηγικές για την επίλυση αυτών των προβλημάτων.Συνήθως ο ρόλος των προσθέτων έχει δύο πτυχές:
δευτερεύουσα δομήτων γονιδίων (δευτερογενής δομή).
Μειώστε τη μη ειδική πλήρωση.
Σήμερα, ο συντάκτης θα σας παρουσιάσει εν συντομία τα κοινά πρόσθετα στις αντιδράσεις PCR και τις λειτουργίες τους.
Πρόσθετα που μειώνουν τη δευτερογενή δομή
σουλφοξείδιο(DMSO)
δείγματα γονιδίωνμε υψηλή περιεκτικότητα σε GC.Ωστόσο, το DMSO μειώνει επίσης πολύ τη δράση της πολυμεράσης Taq.Επομένως, όλοι πρέπει να εξισορροπούν την προσβασιμότητα του προτύπου και τη δραστηριότητα της πολυμεράσης.Ο επεξεργαστής προτείνει να δοκιμάσετε διαφορετικές συγκεντρώσεις DSMO, όπως από 2% έως 10%, για να βρείτε τη συγκέντρωση που ταιριάζει στο πείραμά σας.
Μη ιοντικά απορρυπαντικά
Μη ιοντικά απορρυπαντικά, όπως 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 ή NP-40, συνήθως μειώνουν τη δευτερογενή δομή του DNA.Αν και αυτό μπορεί να αυξήσει την ενίσχυση του γονιδίου εκμαγείου, θα προκαλέσει επίσης το πρόβλημα της μη ειδικής ενίσχυσης.Έτσι, αυτά τα πρόσθετα λειτουργούν καλά για αντιδράσεις PCR χαμηλής απόδοσης χωρίς υπολείμματα, αλλά όχι τόσο καλά για σχετικά ακάθαρτες αντιδράσεις PRC.Ένα άλλο πλεονέκτημα των μη ιοντικών απορρυπαντικών είναι η μείωση της μόλυνσης από SDS.Συνήθως κατά τη διάρκεια της διαδικασίας εξαγωγής DNA, το SDS θα μεταφερθεί στο στάδιο της PCR, το οποίο αναστέλλει σε μεγάλο βαθμό τη δραστηριότητα της πολυμεράσης.Επομένως, η προσθήκη 0,5% Tween-20 ή Tween-40 στην αντίδραση μπορεί να εξουδετερώσει τις αρνητικές επιπτώσεις του SDS.
Βεταΐνη_
Η βεταΐνη μπορεί να βελτιώσει την ενίσχυση του DNA μειώνοντας τον σχηματισμό δευτερογενούς δομής και είναι γενικά μια «μυστήρια» προσθήκη στα εμπορικά κιτ PCR.Εάν θέλετε να χρησιμοποιήσετε βεταΐνη, θα πρέπει να βάλετε βεταΐνη ή μονοένυδρη βεταΐνη (βεταΐνη ή μονοένυδρο βεταΐνη), αλλά όχι υδροχλωρική βεταΐνη (Βεταΐνη HCl), ρυθμίστε σε τελική συγκέντρωση 1-1,7 Μ.Η βηταΐνη μπορεί επίσης να βοηθήσει στη βελτίωση της εξειδίκευσης επειδή εξαλείφει την εξάρτηση της σύνθεσης του ζεύγους βάσεων από τήξη DNA/μετουσίωσης DNA.
Πρόσθετα για τη μείωση του μη ειδικού ασταρώματος
Φορμαμίδη
Το φορμαμίδιο είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο οργανικό πρόσθετο PCR.Μπορεί να συνδυαστεί με κύρια αύλακα και δευτερεύουσα αύλακα στο DNA, μειώνοντας έτσι τη σταθερότητα της διπλής έλικας του κύριου DNA και μειώνοντας τη θερμοκρασία τήξης του DNA.Η συγκέντρωση φορμαμίδης που χρησιμοποιείται σε πειράματα PCR είναι συνήθως 1%-5%.
Τετραμεθυλχλωριούχο αμμώνιο( TMAC)
Το χλωριούχο τετραμεθυλαμμώνιο μπορεί να αυξήσει την ειδικότητα του υβριδισμού (εξειδίκευση υβριδισμού) και να αυξήσει τη θερμοκρασία τήξης του DNA.Έτσι, το TMAC μπορεί να αφαιρέσει τη μη ειδική εκκίνηση και να μειώσει την εσφαλμένη σύνδεση του DNA και του RNA.Εάν χρησιμοποιείτεεκφυλισμένοι εκκινητέςστην αντίδραση PCR, θυμηθείτε να προσθέσετε TMAC, το οποίο χρησιμοποιείται συνήθως σε συγκέντρωση 15-100 mM.
Άλλα κοινά πρόσθετα
Εκτός από τις δύο κατηγορίες προσθέτων που αναφέρθηκαν παραπάνω, υπάρχουν πολλά κοινά πρόσθετα στις αντιδράσεις PCR, αν και έχουν διαφορετικές λειτουργίες, είναι επίσης πολύ σημαντικά.
Ιόν μαγνησίου
Το ιόν μαγνησίου είναι ένας απαραίτητος συμπαράγοντας (συμπαράγοντας) της πολυμεράσης, δηλαδή, χωρίς ιόν μαγνησίου, η πολυμεράση είναι ανενεργή.Ωστόσο, πάρα πολλά ιόντα μαγνησίου μπορεί επίσης να επηρεάσουν την αποτελεσματικότητα της πολυμεράσης.Η συγκέντρωση των ιόντων μαγνησίου σε κάθε αντίδραση PCR θα ποικίλλει.Οι χηλικοί παράγοντες (όπως το EDTA ή το κιτρικό), η συγκέντρωση των dNTPs και των πρωτεϊνών επηρεάζουν τη συγκέντρωση των ιόντων μαγνησίου.Έτσι, εάν έχετε προβλήματα με το πείραμά σας PCR, μπορείτε να προσπαθήσετε να αλλάξετε διαφορετικές συγκεντρώσεις ιόντων μαγνησίου, για παράδειγμα, από 1,0 σε 4,0 mM, με ένα διάστημα μεταξύ 0,5–1 mM.
Αξίζει να σημειωθεί ότι πολλαπλοί κύκλοι κατάψυξης-απόψυξης μπορούν να οδηγήσουν σε διαστρωμάτωση συγκέντρωσης του διαλύματος χλωριούχου μαγνησίου.Επομένως, πρέπει να το διαλύετε εντελώς πριν από κάθε χρήση και να το ανακατεύετε καλά πριν το χρησιμοποιήσετε.
Λευκωματίνη ορού βοοειδών(Βοοειδή λευκωματίνη, BSA)
Σε πειράματα μοριακής χημείας, η αλβουμίνη ορού βοοειδών είναι ένα πολύ κοινό πρόσθετο, ειδικά σε πειράματα πέψης με περιοριστικά ένζυμα και PCR.Στις αντιδράσεις PCR, το BSA είναι χρήσιμο στη μείωση των ρύπων όπως οι φαινολικές ενώσεις.Και λέγεται επίσης ότι μπορεί να μειώσει την πρόσφυση των αντιδρώντων στο τοίχωμα του δοκιμαστικού σωλήνα.Στην αντίδραση PCR, συνήθως η συγκέντρωση του BSA που προστίθεται μπορεί να φτάσει τα 0,8 mg/ml.
 
Σχετικά προϊόντα:
PCR Hero(με βαφή)
PCR Hero