Βάση σχεδίασης ασταριού (99% προβλήματα μπορούν να λυθούν)
1. Μήκος ασταριού: Το σχολικό βιβλίο απαιτεί 15-30bp, συνήθως περίπου 20bp.Η πραγματική συνθήκη είναι καλύτερα να είναι 18-24 bp για να διασφαλιστεί η ειδικότητα, αλλά όσο μεγαλύτερο είναι το καλύτερο, το πολύ μακρύ αστάρι θα μειώσει επίσης την ειδικότητα και θα μειώσει την απόδοση.
2. Διάστημα ενίσχυσης εκκινητών: 200-500bp είναι κατάλληλα και το θραύσμα μπορεί να επεκταθεί στα 10kb υπό συγκεκριμένες συνθήκες.
3. Βάση εκκινητών: Η περιεκτικότητα σε G+C πρέπει να είναι 40-60%, πολύ μικρό αποτέλεσμα ενίσχυσης G+C δεν είναι καλό, πάρα πολύ G+C είναι εύκολο να εμφανιστούν μη ειδικές ζώνες.Το ATGC κατανέμεται καλύτερα τυχαία, αποφεύγοντας συστάδες με περισσότερα από 5 νουκλεοτίδια πουρίνης ή πυριμιδίνης.Multi-gc για το 5' άκρο και ενδιάμεσες ακολουθίες για να αυξήσετε τη σταθερότητα, αποφύγετε την πλούσια GC στο 3' άκρο, χωρίς GC για τις τελευταίες 3 βάσεις ή χωρίς GC για 3 από τις τελευταίες 5 βάσεις.
4. Αποφύγετε τη δευτερογενή δομή στους εκκινητές και αποφύγετε τη συμπλήρωση μεταξύ δύο εκκινητών, ειδικά τη συμπλήρωση στο 3' άκρο, διαφορετικά θα σχηματιστεί διμερές εκκινητή και θα δημιουργηθούν μη ειδικές ενισχυμένες ζώνες.
5. Οι βάσεις στο 3' άκρο των εκκινητών, ειδικά η τελευταία και η προτελευταία βάση, θα πρέπει να ζευγαρώνονται αυστηρά για να αποφευχθεί η αποτυχία της PCR λόγω μη ζευγαρωμένων τερματικών βάσεων.
6. Οι εκκινητές έχουν ή μπορούν να προστεθούν με κατάλληλες θέσεις διάσπασης και η ενισχυμένη αλληλουχία στόχος θα πρέπει κατά προτίμηση να έχει κατάλληλες θέσεις διάσπασης, κάτι που είναι πολύ ωφέλιμο για ανάλυση διάσπασης ή μοριακή κλωνοποίηση.
7. Ειδικότητα εκκινητών: οι εκκινητές δεν πρέπει να έχουν εμφανή ομολογία με άλλες αλληλουχίες στη βάση δεδομένων αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων.
8. Μάθετε να χρησιμοποιείτε λογισμικό: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Αυτή η ηλεκτρονική σχεδίαση λειτουργεί καλύτερα).
Το παραπάνω περιεχόμενο μπορεί να λύσει τουλάχιστον το 99% των προβλημάτων σχεδιασμού ασταριού.
Ελέγξτε τις λεπτομέρειες του σχεδιασμού του ασταριού
1. Μήκος ασταριού
Το γενικό μήκος ασταριού είναι 18~30 βάσεις.Γενικά, ο πιο σημαντικός παράγοντας που καθορίζει τη θερμοκρασία ανόπτησης του ασταριού είναι το μήκος του ασταριού.Η θερμοκρασία ανόπτησης του αστάρι επιλέγεται γενικά (τιμή Tm -5℃) και μερικοί χρησιμοποιούν απευθείας την τιμή Tm.Οι ακόλουθοι τύποι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον χονδρικό υπολογισμό της θερμοκρασίας ανόπτησης των εκκινητών.
Όταν το μήκος του ασταριού είναι μικρότερο από 20 bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Όταν το μήκος του ασταριού είναι μεγαλύτερο από 20 bp: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/μήκος-5℃
Επιπλέον, πολλά λογισμικά μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για τον υπολογισμό της θερμοκρασίας ανόπτησης, η αρχή υπολογισμού θα είναι διαφορετική, επομένως μερικές φορές η υπολογισμένη τιμή μπορεί να έχει ένα μικρό κενό.Για τη βελτιστοποίηση των αντιδράσεων PCR, χρησιμοποιούνται οι συντομότεροι εκκινητές που εξασφαλίζουν θερμοκρασίες ανόπτησης όχι μικρότερες από 54℃ για την καλύτερη απόδοση και ειδικότητα.
Συνολικά, η εξειδίκευση του εκκινητή αυξάνεται κατά τέσσερις φορές για κάθε επιπλέον νουκλεοτίδιο, έτσι ώστε το ελάχιστο μήκος εκκινητή για τις περισσότερες εφαρμογές είναι 18 νουκλεοτίδια.Το ανώτερο όριο του μήκους του εκκινητή δεν είναι πολύ σημαντικό, κυρίως σχετίζεται με την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης.Λόγω της εντροπίας, όσο μεγαλύτερος είναι ο εκκινητής, τόσο χαμηλότερος είναι ο ρυθμός με τον οποίο ανόπτεται για να συνδεθεί με το DNA στόχο για να σχηματίσει ένα σταθερό δίκλωνο εκμαγείο για τη σύνδεση της πολυμεράσης DNA.
Όταν χρησιμοποιείτε λογισμικό για το σχεδιασμό εκκινητών, το μήκος των εκκινητών μπορεί να προσδιοριστεί με τη σειρά της τιμής ΤΜ, ειδικά για εκκινητές φθορισμού ποσοτικής PCR, το TM=60℃ περίπου θα πρέπει να ελέγχεται.
2.Περιεχόμενο GC
Γενικά, η περιεκτικότητα σε G+C στις αλληλουχίες εκκινητών είναι 40%~60%, και η περιεκτικότητα σε GC και η τιμή Tm ενός ζεύγους εκκινητών θα πρέπει να συντονίζονται.Εάν το αστάρι έχει μια σοβαρή τάση GC ή AT, η κατάλληλη ποσότητα A, T ή G και C ουράς μπορεί να προστεθεί στο 5' άκρο του αστάρι.
3. Θερμοκρασία ανόπτησης
Η θερμοκρασία ανόπτησης πρέπει να είναι 5 ℃ χαμηλότερη από τη θερμοκρασία αποσύνδεσης.Εάν ο αριθμός των βάσεων εκκινητών είναι μικρός, η θερμοκρασία ανόπτησης μπορεί να αυξηθεί κατάλληλα, γεγονός που μπορεί να αυξήσει την ειδικότητα της PCR.Εάν ο αριθμός των βάσεων είναι μεγάλος, η θερμοκρασία ανόπτησης μπορεί να μειωθεί κατάλληλα.Η διαφορά θερμοκρασίας ανόπτησης μεταξύ ενός ζεύγους εκκινητών των 4℃ ~ 6℃ δεν θα επηρεάσει την απόδοση της PCR, αλλά ιδανικά η θερμοκρασία ανόπτησης ενός ζεύγους εκκινητών είναι η ίδια, η οποία μπορεί να κυμαίνεται μεταξύ 55℃ ~ 75℃.
4. Αποφύγετε την περιοχή δευτερεύουσας δομής του προτύπου ενίσχυσης
Είναι καλύτερο να αποφεύγετε την περιοχή δευτερεύουσας δομής του προτύπου κατά την επιλογή του ενισχυμένου θραύσματος.Η σταθερή δευτερεύουσα δομή του θραύσματος στόχου μπορεί να προβλεφθεί και να εκτιμηθεί από σχετικό λογισμικό υπολογιστή, το οποίο είναι χρήσιμο για την επιλογή προτύπου.Πειραματικά αποτελέσματα δείχνουν ότι η διαστολή είναι συχνά ανεπιτυχής όταν η ελεύθερη ενέργεια (△G) της περιοχής που πρόκειται να επεκταθεί είναι μικρότερη από 58,6 lkJ/mol.
5. Αναντιστοιχία με το DNA στόχο
Όταν η ενισχυμένη αλληλουχία DNA στόχου είναι μεγάλη, ένας εκκινητής μπορεί να συνδεθεί σε πολλαπλά μέρη του DNA στόχου, με αποτέλεσμα να εμφανίζονται πολλαπλές ζώνες στο αποτέλεσμα.Αυτή τη φορά είναι απαραίτητο να χρησιμοποιήσετε τη δοκιμή λογισμικού BLAST, ιστοσελίδα:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Επιλέξτε Στοίχιση δύο ακολουθιών (bl2seq).
Η επικόλληση των αλληλουχιών εκκινητών στη ζώνη 1 και των αλληλουχιών DNA στόχου στη ζώνη 2 είναι εναλλάξιμα και το BLAST υπολογίζει συμπληρωματικές, αντιπληροφοριακές και άλλες πιθανότητες, επομένως οι χρήστες δεν χρειάζεται να παρατηρήσουν εάν και οι δύο αλυσίδες είναι αλυσίδες αίσθησης.Μπορείτε επίσης να εισαγάγετε τον αριθμό GI εάν γνωρίζετε τον αριθμό GI της ακολουθίας στη βάση δεδομένων, ώστε να μην χρειάζεται να επικολλήσετε ένα μεγάλο τμήμα της ακολουθίας.Τέλος, κάντε κλικ στο Align at 3 για να δείτε εάν ο εκκινητής έχει πολλαπλές ομόλογες θέσεις στο DNA-στόχο.
6. Τερματικό αστάρι
Το 3' άκρο του ασταριού είναι το σημείο όπου αρχίζει η επέκταση, επομένως είναι σημαντικό να αποτρέψετε την έναρξη των αναντιστοιχιών.Το άκρο 3' δεν πρέπει να είναι περισσότερο από 3 διαδοχικά G ή C, επειδή αυτό θα προκαλέσει την εσφαλμένη ενεργοποίηση του εκκινητή στην περιοχή της αλληλουχίας εμπλουτισμού G+C.Το 3' άκρο δεν μπορεί να σχηματίσει καμία δευτερεύουσα δομή, εκτός από τις ειδικές αντιδράσεις PCR (AS-PCR), το άκρο 3' του εκκινητή δεν μπορεί να είναι αναντιστοιχία.Για παράδειγμα, εάν η περιοχή κωδικοποίησης είναι ενισχυμένη, το 3' άκρο του εκκινητή δεν θα πρέπει να τερματίζεται στην τρίτη θέση του κωδικονίου, επειδή η τρίτη θέση του κωδικονίου είναι επιρρεπής σε εκφυλισμό, γεγονός που θα επηρεάσει την ειδικότητα και την αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης.Όταν χρησιμοποιείτε εκκινητές προσάρτησης, ανατρέξτε στον πίνακα χρήσης κωδικονίων, δώστε προσοχή στη βιολογική προτίμηση, μην χρησιμοποιείτε εκκινητές προσάρτησης στο άκρο 3' και χρησιμοποιήστε υψηλότερη συγκέντρωση εκκινητών (1uM-3uM).
7. Δευτερεύουσα δομή εκκινητών
Οι ίδιοι οι εκκινητές δεν θα πρέπει να έχουν συμπληρωματικές αλληλουχίες, διαφορετικά οι ίδιοι οι εκκινητές θα διπλωθούν σε δομές φουρκέτας και αυτή η δευτερεύουσα δομή θα επηρεάσει τη σύνδεση των εκκινητών και των προτύπων λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης.Εάν χρησιμοποιείται τεχνητή κρίση, οι συνεχείς συμπληρωματικές βάσεις των ίδιων των εκκινητών δεν πρέπει να είναι μεγαλύτερες από 3 bp.Δεν πρέπει να υπάρχει συμπληρωματικότητα μεταξύ των δύο εκκινητών, ειδικά η συμπληρωματική επικάλυψη του άκρου 3' θα πρέπει να αποφεύγεται για να αποφευχθεί ο σχηματισμός διμερών εκκινητών.Γενικά, δεν πρέπει να υπάρχουν περισσότερες από 4 διαδοχικές ομολογία βάσεων ή συμπληρωματικότητα μεταξύ ενός ζεύγους εκκινητών.
8. Προσθέστε δείκτες ή τόπους
Το 5' άκρο έχει μικρή επίδραση στην ειδικότητα ενίσχυσης και επομένως μπορεί να τροποποιηθεί χωρίς να επηρεαστεί η εξειδίκευση ενίσχυσης.Η τροποποίηση του άκρου του εκκινητή 5 περιελάμβανε: προσθήκη θέσης περιορισμού ενζύμου.Επισημασμένη βιοτίνη, φθορισμός, διγοξίνη, Eu3+, κ.λπ. Εισαγωγή αλληλουχιών DNA που δεσμεύουν πρωτεΐνες.Εισαγωγή θέσεων μετάλλαξης, εισαγωγή και έλλειψη αλληλουχιών μετάλλαξης και εισαγωγή αλληλουχιών προαγωγέα, κ.λπ. Οι επιπλέον βάσεις θα επηρεάσουν περισσότερο ή λιγότερο την αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης και θα αυξήσουν την πιθανότητα σχηματισμού διμερούς εκκινητή, αλλά πρέπει να γίνουν κάποιες παραχωρήσεις για το επόμενο βήμα.Επιπρόσθετες αλληλουχίες που δεν υπάρχουν στην αλληλουχία στόχο, όπως θέσεις περιορισμού και αλληλουχίες προαγωγέα, μπορούν να προστεθούν στο 5' άκρο του εκκινητή χωρίς να επηρεαστεί η εξειδίκευση.Αυτές οι αλληλουχίες δεν περιλαμβάνονται στον υπολογισμό των τιμών του εκκινητή Tm, αλλά θα πρέπει να ελεγχθούν για συμπληρωματικότητα και εσωτερική δευτερεύουσα δομή.
9. Υποκλώνοι
Τις περισσότερες φορές, η PCR είναι μόνο προκαταρκτική κλωνοποίηση και στη συνέχεια πρέπει να υποκλωνοποιήσουμε το θραύσμα στόχο σε διάφορους φορείς, επομένως πρέπει να σχεδιάσουμε πρόσθετες βάσεις για την επόμενη λειτουργία στο βήμα PCR.
Μερικές αλληλουχίες σχεδιασμένες για υποκλωνοποίηση συνοψίζονται παρακάτω.
Προστέθηκε θέση περιορισμού ενδονουκλεάσης περιορισμού
Η προσθήκη θέσεων περιορισμού ενζύμου είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος για την υποκλωνοποίηση προϊόντων PCR.Γενικά, η θέση διάσπασης είναι έξι βάσεις, εκτός από το 5' άκρο της θέσης διάσπασης πρέπει να προσθέσετε 2 ~ 3 προστατευτικές βάσεις.Ωστόσο, ο αριθμός των προστατευτικών βάσεων που απαιτούνται από διαφορετικά ένζυμα είναι διαφορετικός.Για παράδειγμα, το SalⅠ δεν απαιτεί προστατευτική βάση, το EcoRⅤ απαιτεί 1 προστατευτική βάση, το NotⅠ απαιτεί 2 προστατευτικές βάσεις και το Hind Ⅲ απαιτεί 3 προστατευτικές βάσεις.
Το LIC προσθέτει την ουρά
Η πλήρης ονομασία του LIC είναι κλωνοποίηση ανεξάρτητη από την απολίνωση, μια μέθοδος κλωνοποίησης που εφευρέθηκε από τη Navogen ειδικά για το μέρος του φορέα pET.Ο φορέας ρΕΤ που παρασκευάζεται με τη μέθοδο LIC έχει μη συμπληρωματικά κολλώδη άκρα μονής έλικας 12-15 βάσεων, τα οποία συμπληρώνουν τα αντίστοιχα κολλώδη άκρα στο τεμάχιο ένθετου στόχου.Για σκοπούς ενίσχυσης, η αλληλουχία εκκινητή 5' του εισαγόμενου θραύσματος θα πρέπει να συμπληρώνει τον φορέα LIC.Η 3'→5' εξωσυνεκτική δραστηριότητα της Τ4 DNA πολυμεράσης μπορεί να σχηματίσει ένα μονόκλωνο κολλώδες άκρο στο εισαγόμενο θραύσμα μετά από σύντομο χρονικό διάστημα.Επειδή το προϊόν μπορεί να σχηματιστεί μόνο από την αμοιβαία ανόπτηση του παρασκευασμένου τμήματος ένθετου και του φορέα, αυτή η μέθοδος είναι πολύ γρήγορη και αποτελεσματική και είναι κατευθυνόμενη κλωνοποίηση.
Κατευθυνόμενος κλώνος ΤΑ προσθήκη ουράς
Η κλωνοποίηση ΤΑ δεν μπόρεσε να στοχεύσει το θραύσμα σε φορέα, έτσι αργότερα η Invitrogen εισήγαγε έναν φορέα που θα μπορούσε να στοχεύσει την κλωνοποίηση, ο οποίος περιείχε τέσσερις εξέχουσες βάσεις GTGGS στο ένα άκρο.Ως εκ τούτου, στο σχεδιασμό των εκκινητών PCR, θα πρέπει να προστεθούν συμπληρωματικές αλληλουχίες ανάλογα, έτσι ώστε τα θραύσματα να μπορούν να «προσανατολιστούν».
Εάν δεν έχετε χρόνο, μπορείτε να δοκιμάσετε την άμεση σύνθεση, συνδυάζοντας το γονίδιο με τον φορέα, που είναι αυτό που ονομάζουμε σύνθεση γονιδίου ET στους μυϊκούς.
Δ. Μέθοδος κλωνοποίησης In-Fusion
Δεν απαιτείται λιγάση, δεν απαιτείται μακρά αντίδραση.Εφόσον εισάγεται μια αλληλουχία και στα δύο άκρα του γραμμικοποιημένου φορέα Στο σχεδιασμό των εκκινητών, τότε το προϊόν PCR και ο γραμμικοποιημένος φορέας προστίθενται στο διάλυμα ενζύμου έγχυσης που περιέχει BSA και τοποθετούνται σε θερμοκρασία δωματίου για μισή ώρα, ο μετασχηματισμός μπορεί να πραγματοποιηθεί.Αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για μετατροπή μεγάλου όγκου.
10. Συγχώνευση αστάρι
Μερικές φορές, είναι γνωστές μόνο περιορισμένες πληροφορίες αλληλουχίας σχετικά με το σχεδιασμό εκκινητών.Για παράδειγμα, εάν είναι γνωστή μόνο η αλληλουχία αμινοξέων, μπορεί να σχεδιαστεί ο εκκινητής συγχώνευσης.Ένας εκκινητής συγχώνευσης είναι ένα μείγμα διαφορετικών αλληλουχιών που αντιπροσωπεύουν όλες τις διαφορετικές δυνατότητες βάσεων που κωδικοποιούν ένα μόνο αμινοξύ.Για να αυξήσετε την εξειδίκευση, μπορείτε να ανατρέξετε στον πίνακα χρήσης κωδικονίων για να μειώσετε την προσάρτηση σύμφωνα με τις βασικές προτιμήσεις χρήσης διαφορετικών οργανισμών.Η υποξανθίνη μπορεί να συνδυαστεί με όλες τις βάσεις για μείωση της θερμοκρασίας ανόπτησης του ασταριού.Μη χρησιμοποιείτε τις προσαρτημένες βάσεις στο 3′ άκρο του εκκινητή γιατί η ανόπτηση των τελευταίων 3 βάσεων στο άκρο 3′ είναι επαρκής για την έναρξη της PCR σε λάθος θέση.Χρησιμοποιούνται υψηλότερες συγκεντρώσεις εκκινητών (1μM έως 3μM) επειδή οι εκκινητές σε πολλά μείγματα προσάρτησης δεν είναι ειδικά για το πρότυπο-στόχο.
Πρώτες ύλες PCRέλεγχος
1. Ποσότητα ασταριού
Η συγκέντρωση κάθε εκκινητή είναι 0,1 ~ 1 umol ή 10 ~ 100 pmol.Είναι καλύτερα να παράγετε το απαιτούμενο αποτέλεσμα με τη μικρότερη ποσότητα αστάρι.Η υψηλή συγκέντρωση εκκινητών θα προκαλέσει αναντιστοιχία και μη ειδική ενίσχυση και θα αυξήσει την πιθανότητα σχηματισμού διμερών μεταξύ των εκκινητών.
2. Συγκέντρωση ασταριού
Η συγκέντρωση των εκκινητών επηρεάζει την ειδικότητα.Η βέλτιστη συγκέντρωση εκκινητή είναι γενικά μεταξύ 0,1 και 0,5 μΜ.Υψηλότερες συγκεντρώσεις εκκινητών οδηγούν σε ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων.
3. Θερμοκρασία ανόπτησης ασταριού
Μια άλλη σημαντική παράμετρος για τα αστάρια είναι η θερμοκρασία τήξης (Tm).Αυτή είναι η θερμοκρασία όταν το 50% των εκκινητών και των συμπληρωματικών αλληλουχιών αντιπροσωπεύονται ως δίκλωνα μόρια DNA.Το Tm απαιτείται για τη ρύθμιση της θερμοκρασίας ανόπτησης PCR.Ιδανικά, η θερμοκρασία ανόπτησης είναι αρκετά χαμηλή ώστε να εξασφαλίζει αποτελεσματική ανόπτηση των εκκινητών με την αλληλουχία στόχο, αλλά αρκετά υψηλή ώστε να μειώνεται η μη ειδική δέσμευση.Λογική θερμοκρασία ανόπτησης από 55℃ έως 70℃.Η θερμοκρασία ανόπτησης είναι γενικά ρυθμισμένη κατά 5℃ χαμηλότερη από το Tm του αστάρι.
Υπάρχουν αρκετοί τύποι για τη ρύθμιση του Tm, οι οποίοι ποικίλλουν σημαντικά ανάλογα με τον τύπο που χρησιμοποιείται και την αλληλουχία των εκκινητών.Επειδή οι περισσότεροι τύποι παρέχουν μια εκτιμώμενη τιμή Tm, όλες οι θερμοκρασίες ανόπτησης είναι μόνο ένα σημείο εκκίνησης.Η ειδικότητα μπορεί να βελτιωθεί αναλύοντας αρκετές αντιδράσεις που αυξάνουν προοδευτικά τη θερμοκρασία ανόπτησης.Ξεκινήστε κάτω από το εκτιμώμενο Tm-5℃ και αυξήστε σταδιακά τη θερμοκρασία ανόπτησης κατά 2℃.Η υψηλότερη θερμοκρασία ανόπτησης θα μειώσει τον σχηματισμό διμερών εκκινητών και μη ειδικών προϊόντων.Για καλύτερα αποτελέσματα, οι δύο εκκινητές θα πρέπει να έχουν κατά προσέγγιση τιμές Tm.Εάν η διαφορά Tm των ζευγών εκκινητών είναι μεγαλύτερη από 5℃, οι εκκινητές θα εμφανίσουν σημαντική εσφαλμένη εκκίνηση χρησιμοποιώντας χαμηλότερη θερμοκρασία ανόπτησης στον κύκλο.Εάν οι δύο εκκινητές Tm είναι διαφορετικοί, ρυθμίστε τη θερμοκρασία ανόπτησης σε 5℃ χαμηλότερη από τη χαμηλότερη Tm.Εναλλακτικά, για να αυξηθεί η ειδικότητα, πέντε κύκλοι μπορούν να εκτελεστούν πρώτα σε θερμοκρασίες ανόπτησης που έχουν σχεδιαστεί για υψηλότερη Tm, ακολουθούμενοι από τους υπόλοιπους κύκλους σε θερμοκρασίες ανόπτησης που έχουν σχεδιαστεί για χαμηλότερη Tm.Αυτό επιτρέπει τη λήψη μερικού αντιγράφου του προτύπου προορισμού υπό αυστηρές συνθήκες.
4. Καθαρότητα και σταθερότητα ασταριού
Η τυπική καθαρότητα των προσαρμοσμένων εκκινητών είναι επαρκής για τις περισσότερες εφαρμογές PCR.Η απομάκρυνση των ομάδων βενζοϋλίου και ισοβουτυλυλίου με αφαλάτωση είναι ελάχιστη και επομένως δεν παρεμβαίνει στην PCR.Ορισμένες εφαρμογές απαιτούν καθαρισμό για την αφαίρεση τυχόν μη πλήρους μήκους αλληλουχίες στη διαδικασία σύνθεσης.Αυτές οι περικομμένες αλληλουχίες εμφανίζονται επειδή η αποτελεσματικότητα της χημείας σύνθεσης DNA δεν είναι 100%.Αυτή είναι μια κυκλική διαδικασία που χρησιμοποιεί επαναλαμβανόμενες χημικές αντιδράσεις καθώς κάθε βάση προστίθεται για να δημιουργήσει DNA από 3' έως 5'.Μπορείτε να αποτύχετε σε κάθε κύκλο.Μεγαλύτεροι εκκινητές, ειδικά εκείνοι μεγαλύτεροι από 50 βάσεις, έχουν μεγάλη αναλογία περικομμένων αλληλουχιών και μπορεί να απαιτούν καθαρισμό.
Η απόδοση των εκκινητών επηρεάζεται από την αποτελεσματικότητα της συνθετικής χημείας και τη μέθοδο καθαρισμού.Οι βιοφαρμακευτικές εταιρείες, όπως η Cytology και η Shengong, χρησιμοποιούν όλες μια ελάχιστη μονάδα OD για να εξασφαλίσουν τη συνολική παραγωγή ολιγονουκλεοσιδίου.Τα προσαρμοσμένα αστάρια αποστέλλονται σε μορφή ξηρής σκόνης.Είναι καλύτερο να επαναδιαλυθούν οι εκκινητές σε ΤΕ έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 100μM.Το ΤΕ είναι καλύτερο από το απιονισμένο νερό επειδή το pH του νερού είναι συχνά όξινο και προκαλεί την υδρόλυση των ολιγονουκλεοσιδίων.
Η σταθερότητα των ασταριών εξαρτάται από τις συνθήκες αποθήκευσης.Η ξηρή σκόνη και τα διαλυμένα αστάρια πρέπει να φυλάσσονται στους -20℃.Τα αστάρια διαλυμένα σε ΤΕ σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 10μM μπορούν να αποθηκευτούν σταθερά στους -20℃ για 6 μήνες, αλλά μπορούν να αποθηκευτούν μόνο σε θερμοκρασία δωματίου (15℃ έως 30℃) για λιγότερο από 1 εβδομάδα.Τα αστάρια ξηρής σκόνης μπορούν να αποθηκευτούν στους -20 C για τουλάχιστον 1 έτος και σε θερμοκρασία δωματίου (15 C έως 30 C) για έως και 2 μήνες.
5. Ένζυμα και οι συγκεντρώσεις τους
Επί του παρόντος, η πολυμεράση Taq DNA που χρησιμοποιείται είναι βασικά το ένζυμο γονιδιακής μηχανικής που συντίθεται από κολοβακτηρίδια.Η ποσότητα του ενζύμου που απαιτείται για την κατάλυση μιας τυπικής αντίδρασης PCR είναι περίπου 2,5 U (αναφέρεται στον συνολικό όγκο αντίδρασης 100 μΙ).Εάν η συγκέντρωση είναι πολύ υψηλή, μπορεί να οδηγήσει σε μη ειδική ενίσχυση.Εάν η συγκέντρωση είναι πολύ χαμηλή, η ποσότητα του συνθετικού προϊόντος θα μειωθεί.
6. Ποιότητα και συγκέντρωση dNTP
Η ποιότητα του dNTP σχετίζεται στενά με τη συγκέντρωση και την αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης PCR.Η σκόνη dNTP είναι κοκκώδης και η μεταβλητότητά της χάνει τη βιολογική της δραστηριότητα εάν αποθηκευτεί ακατάλληλα.Το διάλυμα dNTP είναι όξινο και θα πρέπει να χρησιμοποιείται σε υψηλή συγκέντρωση, με ρυθμιστικό διάλυμα 1M NaOH ή 1M Tris.HCL για να ρυθμίσει το PH του σε 7,0 ~ 7,5, μικρή ποσότητα υποσυσκευασίας, αποθήκευση κατεψυγμένη στους -20℃.Η πολλαπλή κατάψυξη-απόψυξη θα υποβαθμίσει το dNTP.Στην αντίδραση PCR, το dNTP θα πρέπει να είναι 50 ~ 200 umol/L.Ιδιαίτερα, θα πρέπει να δοθεί προσοχή στη συγκέντρωση των τεσσάρων DNTPS θα πρέπει να είναι ίση (ίση μοριακή προετοιμασία).Εάν η συγκέντρωση οποιουδήποτε από αυτά είναι διαφορετική από τα άλλα (μεγαλύτερη ή χαμηλότερη), θα προκληθεί αναντιστοιχία.Πολύ χαμηλή συγκέντρωση θα μειώσει την απόδοση των προϊόντων PCR.Το dNTP μπορεί να συνδυαστεί με το Mg2+ και να μειώσει τη συγκέντρωση του ελεύθερου Mg2+.
7. Πρότυπο (γονίδιο στόχος) νουκλεϊκό οξύ
Η ποσότητα και ο βαθμός καθαρισμού του εκμαγείου νουκλεϊκού οξέος είναι ένας από τους βασικούς κρίκους για την επιτυχία ή την αποτυχία της PCR.Οι παραδοσιακές μέθοδοι καθαρισμού DNA χρησιμοποιούν συνήθως SDS και πρωτεάση Κ για την πέψη και τη διάθεση των δειγμάτων.Οι κύριες λειτουργίες του SDS είναι: διαλύει λιπίδια και πρωτεΐνες στην κυτταρική μεμβράνη, καταστρέφοντας έτσι την κυτταρική μεμβράνη διαλύοντας τις πρωτεΐνες της μεμβράνης και διαχωρίζει τις πυρηνικές πρωτεΐνες στο κύτταρο, το SDS μπορεί επίσης να συνδυαστεί με πρωτεΐνες και να κατακρημνιστεί.Η πρωτεάση Κ μπορεί να υδρολύσει και να αφομοιώσει πρωτεΐνες, ιδιαίτερα τις ιστόνες που συνδέονται με το DNA, και στη συνέχεια να χρησιμοποιήσει οργανικό διαλύτη φαινόλη και χλωροφόρμιο για να εκχυλίσει πρωτεΐνες και άλλα κυτταρικά συστατικά και να χρησιμοποιήσει αιθανόλη ή ισοπροπυλική αλκοόλη για να κατακρημνίσει νουκλεϊκό οξύ.Το εκχυλισμένο νουκλεϊκό οξύ μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εκμαγείο για αντιδράσεις PCR.Για δείγματα γενικής κλινικής ανίχνευσης, μια γρήγορη και απλή μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάλυση κυττάρων, τη λύση παθογόνων, την πέψη και την απομάκρυνση πρωτεϊνών από τα χρωμοσώματα στα ελεύθερα γονίδια-στόχους και απευθείας για την ενίσχυση PCR.Η εκχύλιση μήτρας RNA χρησιμοποιεί συνήθως τη μέθοδο ισοθειοκυανικής γουανιδίνης ή πρωτεάσης Κ για να αποτρέψει την αποικοδόμηση του RNA της RNase.
Συγκέντρωση 8.Mg2+
Το Mg2+ έχει σημαντική επίδραση στην ειδικότητα και την απόδοση της ενίσχυσης PCR.Στη γενική αντίδραση PCR, όταν η συγκέντρωση διαφόρων dNTP είναι 200 umol/L, η κατάλληλη συγκέντρωση Mg2+ είναι 1,5 ~ 2,0 mmol/L.Η συγκέντρωση Mg2+ είναι πολύ υψηλή, η ειδικότητα της αντίδρασης μειώνεται, λαμβάνει χώρα μη ειδική ενίσχυση, πολύ χαμηλή συγκέντρωση θα μειώσει τη δραστηριότητα της Taq DNA πολυμεράσης, με αποτέλεσμα τη μείωση των προϊόντων αντίδρασης.
Τα ιόντα μαγνησίου επηρεάζουν διάφορες πτυχές της PCR, όπως η δραστηριότητα της DNA πολυμεράσης, η οποία επηρεάζει την απόδοση.Ένα άλλο παράδειγμα είναι η ανόπτηση με αστάρι, η οποία επηρεάζει την εξειδίκευση.Το dNTP και το εκμαγείο συνδέονται με ιόν μαγνησίου, μειώνοντας την ποσότητα του ελεύθερου ιόντος μαγνησίου που απαιτείται για τη δραστηριότητα του ενζύμου.Η βέλτιστη συγκέντρωση ιόντων μαγνησίου ποικίλλει για διαφορετικά ζεύγη εκκινητών και πρότυπα, αλλά μια τυπική αρχική συγκέντρωση PCR με 200μM dNTP είναι 1,5 mM (σημείωση: Για ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο, χρησιμοποιήστε διάλυμα ιόντων μαγνησίου 3 έως 5 mM με φθορίζον ανιχνευτή).Υψηλότερες συγκεντρώσεις ελεύθερων ιόντων μαγνησίου αυξάνουν την απόδοση, αλλά επίσης αυξάνουν τη μη ειδική ενίσχυση και μειώνουν την πιστότητα.Για να προσδιοριστεί η βέλτιστη συγκέντρωση, πραγματοποιήθηκαν τιτλοδοτήσεις ιόντων μαγνησίου σε βήματα των 0,5 mM από 1 mM έως 3 mM.Για να μειωθεί η εξάρτηση από τη βελτιστοποίηση ιόντων μαγνησίου, μπορεί να χρησιμοποιηθεί η πολυμεράση Platinum Taq DNA.Η πολυμεράση Platinum Taq DNA είναι σε θέση να διατηρεί τη λειτουργία σε ένα ευρύτερο φάσμα συγκεντρώσεων ιόντων μαγνησίου από την πολυμεράση Taq DNA και επομένως απαιτεί λιγότερη βελτιστοποίηση.
9. Πρόσθετα που προάγουν την Pcr
Η βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας ανόπτησης, ο σχεδιασμός του εκκινητή και η συγκέντρωση ιόντων μαγνησίου είναι επαρκής για την εξαιρετικά ειδική ενίσχυση των περισσότερων προτύπων.Ωστόσο, ορισμένα πρότυπα, συμπεριλαμβανομένων εκείνων με υψηλό περιεχόμενο GC, απαιτούν πρόσθετα μέτρα.Τα πρόσθετα που επηρεάζουν τη θερμοκρασία τήξης του DNA παρέχουν έναν άλλο τρόπο βελτίωσης της εξειδίκευσης και της απόδοσης του προϊόντος.Απαιτείται πλήρης μετουσίωση του προτύπου για καλύτερα αποτελέσματα.
Επιπλέον, η δευτερεύουσα δομή αποτρέπει τη σύνδεση του εκκινητή και την επέκταση του ενζύμου.
Τα πρόσθετα PCR, συμπεριλαμβανομένων φορμαμίδης, DMSO, γλυκερίνης, βεταΐνης και διαλύματος ενίσχυσης PCRx, ενισχύουν την ενίσχυση.Ο πιθανός μηχανισμός τους είναι να μειώσουν τη θερμοκρασία τήξης, βοηθώντας έτσι την ανόπτηση των εκκινητών και υποβοηθώντας την επέκταση της DNA πολυμεράσης μέσω της περιοχής δευτερογενούς δομής.Το διάλυμα PCRx έχει άλλα πλεονεκτήματα.Απαιτείται ελάχιστη βελτιστοποίηση ιόντων μαγνησίου όταν χρησιμοποιείται με πολυμεράση DNA Platinum Taq και πολυμεράση DNA Platinum Pfx.Έτσι, η τεχνική Platinum συνδυάζεται με το πρόσθετο για να αυξήσει την ειδικότητα μειώνοντας παράλληλα την εξάρτηση της τρίτης προσέγγισης, τη βελτιστοποίηση ιόντων μαγνησίου.Για καλύτερα αποτελέσματα, η συγκέντρωση των προσθέτων θα πρέπει να βελτιστοποιηθεί, ιδιαίτερα το DMSO, η φορμαμίδη και η γλυκερόλη, που αναστέλλουν την πολυμεράση του Taq DNA.
10. Καυτό ξεκίνημα
Η Hot start PCR είναι μια από τις πιο σημαντικές μεθόδους για τη βελτίωση της ειδικότητας της PCR εκτός από τον καλό σχεδιασμό εκκινητών.Αν και η βέλτιστη θερμοκρασία επιμήκυνσης της πολυμεράσης Taq DNA είναι 72℃, η πολυμεράση παραμένει ενεργή σε θερμοκρασία δωματίου.Έτσι, παράγονται μη ειδικά προϊόντα όταν η θερμοκρασία διατήρησης είναι χαμηλότερη από τη θερμοκρασία ανόπτησης κατά την προετοιμασία της αντίδρασης PCR και στην αρχή του θερμικού κύκλου.Μόλις σχηματιστούν, αυτά τα μη ειδικά προϊόντα ενισχύονται αποτελεσματικά.Η PCR θερμής εκκίνησης είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική όταν οι θέσεις που χρησιμοποιούνται για το σχεδιασμό εκκινητών περιορίζονται από τη θέση των γενετικών στοιχείων, όπως οι κατευθυνόμενες μεταλλάξεις, η κλωνοποίηση έκφρασης ή η κατασκευή και ο χειρισμός γενετικών στοιχείων που χρησιμοποιούνται για τη μηχανική DNA.
Μια κοινή μέθοδος για τον περιορισμό της δραστηριότητας της Taq DNA πολυμεράσης είναι η παρασκευή διαλύματος αντίδρασης PCR σε πάγο και η τοποθέτησή του σε μια προθερμασμένη συσκευή PCR.Αυτή η μέθοδος είναι απλή και φθηνή, αλλά δεν ολοκληρώνει τη δραστηριότητα του ενζύμου και επομένως δεν εξαλείφει εντελώς την ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων.
Η θερμική εκκίνηση καθυστερεί τη σύνθεση του DNA αναστέλλοντας ένα βασικό συστατικό έως ότου η συσκευή PCR φτάσει σε θερμοκρασία μετουσίωσης.Οι περισσότερες μέθοδοι χειροκίνητης θερμικής εκκίνησης, συμπεριλαμβανομένης της καθυστερημένης προσθήκης της πολυμεράσης DNA Taq, είναι περίπλοκες, ειδικά για εφαρμογές υψηλής απόδοσης.Άλλες μέθοδοι θερμικής εκκίνησης χρησιμοποιούν μια ασπίδα κεριού για να περικλείσουν ένα βασικό συστατικό, συμπεριλαμβανομένων ιόντων μαγνησίου ή ενζύμων, ή για να απομονώσουν φυσικά δραστικά συστατικά, όπως εκμαγεία και ρυθμιστικά διαλύματα.Κατά τη διάρκεια του θερμικού κύκλου, τα διάφορα συστατικά απελευθερώνονται και αναμιγνύονται μαζί καθώς το κερί λιώνει.Όπως η μέθοδος χειροκίνητης θερμής εκκίνησης, η μέθοδος προστασίας από κερί είναι δυσκίνητη και επιρρεπής σε μόλυνση και δεν είναι κατάλληλη για εφαρμογές υψηλής απόδοσης.
Η πολυμεράση DNA της πλατίνας είναι βολική και αποτελεσματική για αυτόματη θερμή εκκίνηση PCR.Η πολυμεράση Platinum Taq DNA αποτελείται από ανασυνδυασμένη πολυμεράση Taq DNA σε συνδυασμό με μονοκλωνικό αντίσωμα κατά της πολυμεράσης DNA Taq.Τα αντισώματα διαμορφώνονται με PCR για την αναστολή της ενζυμικής δραστηριότητας κατά τη διάρκεια παρατεταμένης διατήρησης της θερμοκρασίας.Η πολυμεράση Taq DNA απελευθερώθηκε στην αντίδραση κατά τη διάρκεια της μόνωσης 94℃ του σταδίου μετουσίωσης, αποκαθιστώντας την πλήρη δραστηριότητα πολυμεράσης.Σε αντίθεση με την χημικά τροποποιημένη Taq DNA πολυμεράση για θερμική εκκίνηση, το ένζυμο Platinum δεν απαιτεί παρατεταμένη μόνωση στους 94℃ (10 έως 15 λεπτά) για την ενεργοποίηση της πολυμεράσης.Με την πολυμεράση DNA PlatinumTaq, το 90% της δραστηριότητας της Taq DNA πολυμεράσης αποκαταστάθηκε μετά από 2 λεπτά στους 94℃.
11. Nest-PCR
Διαδοχικοί γύροι ενίσχυσης με χρήση ένθετων εκκινητών μπορούν να βελτιώσουν την ειδικότητα και την ευαισθησία.Ο πρώτος γύρος είναι μια τυπική ενίσχυση 15 έως 20 κύκλων.Ένα μικρό κλάσμα του προϊόντος αρχικής ενίσχυσης αραιώθηκε 100 έως 1000 φορές και προστέθηκε στον δεύτερο γύρο ενίσχυσης για 15 έως 20 κύκλους.Εναλλακτικά, το αρχικό ενισχυμένο προϊόν μπορεί να μετρηθεί με καθαρισμό γέλης.Ένας ένθετος εκκινητής χρησιμοποιείται στον δεύτερο γύρο ενίσχυσης, ο οποίος μπορεί να συνδεθεί με την αλληλουχία στόχο μέσα στον πρώτο εκκινητή.Η χρήση ένθετης PCR μειώνει την πιθανότητα ενίσχυσης πολλαπλών θέσεων στόχων επειδή υπάρχουν λίγες αλληλουχίες στόχου συμπληρωματικές και στα δύο σετ εκκινητών.Ο ίδιος συνολικός αριθμός κύκλων (30 έως 40) με τους ίδιους εκκινητές ενίσχυσε τις μη ειδικές θέσεις.Η Nested PCR αυξάνει την ευαισθησία των περιορισμένων αλληλουχιών-στόχων (π.χ. σπάνιες mrnas) και βελτιώνει την ειδικότητα των δύσκολων PCRS (π.χ. 5' RACE).
12. Φθίνουσα PCR
Η φθίνουσα PCR βελτιώνει την ειδικότητα χρησιμοποιώντας αυστηρές συνθήκες ανόπτησης για τους πρώτους λίγους κύκλους PCR.Ο κύκλος ξεκινά σε θερμοκρασία ανόπτησης περίπου 5℃ υψηλότερη από την εκτιμώμενη Tm, στη συνέχεια κάθε κύκλος μειώνεται κατά 1℃ έως 2℃ έως ότου η θερμοκρασία ανόπτησης είναι κάτω από Tm 5℃.Μόνο το πρότυπο προορισμού με την υψηλότερη ομολογία θα ενισχυθεί.Αυτά τα προϊόντα συνεχίζουν να επεκτείνονται στους επόμενους κύκλους, παραγκωνίζοντας τα ενισχυμένα μη ειδικά προϊόντα.Η φθίνουσα PCR είναι χρήσιμη για μεθόδους όπου ο βαθμός ομολογίας μεταξύ εκκινητή και εκμαγείου στόχου δεν είναι γνωστός, όπως η λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA AFLP.
Σχετικά κιτ PCR
Το 2× PCR HeroTMΤο σύστημα Mix έχει υψηλότερη ανοχή στους αναστολείς PCR από το συνηθισμένο σύστημα PCR Mix και μπορεί εύκολα να αντιμετωπίσει την ενίσχυση PCR διαφόρων πολύπλοκων προτύπων.Το μοναδικό σύστημα αντίδρασης και το υψηλής απόδοσης Taq Hero κάνουν την αντίδραση PCR να έχει υψηλότερη απόδοση ενίσχυσης, ειδικότητα και ευαισθησία.
Υψηλότερη απόδοση ενίσχυσης
Έχει δραστικότητα 5'→3' DNA πολυμεράσης και δραστικότητα εξωνουκλεάσης 5'→3', χωρίς δράση εξωνουκλεάσης 3'→5'.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Ειδικό — το βελτιστοποιημένο ρυθμιστικό διάλυμα και το ένζυμο Taq θερμής εκκίνησης μπορούν να αποτρέψουν τη μη ειδική ενίσχυση και τον σχηματισμό διμερών εκκινητών
Υψηλή ευαισθησία—μπορεί να εντοπίσει χαμηλά αντίγραφα προτύπου
Το κιτ χρησιμοποιεί ένα μοναδικό αντιδραστήριο αντίστροφης μεταγραφής Foregene και Foregene HotStar Taq DNA Polymerase σε συνδυασμό με ένα μοναδικό σύστημα αντίδρασης για να βελτιώσει αποτελεσματικά την αποτελεσματικότητα ενίσχυσης και την ειδικότητα της αντίδρασης.
Ώρα δημοσίευσης: Μάιος-09-2023
