Η άμεση PCR είναι μια αντίδραση που χρησιμοποιεί απευθείας ζωικούς ή φυτικούς ιστούς για ενίσχυση χωρίς εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος.Με πολλούς τρόπους, η άμεση PCR λειτουργεί όπως η κανονική PCR

Η κύρια διαφορά είναι το προσαρμοσμένο ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιείται στην άμεση PCR, το δείγμα μπορεί να υποβληθεί απευθείας στην αντίδραση PCR χωρίς εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος, αλλά υπάρχουν αντίστοιχες απαιτήσεις για την ανοχή των ενζύμων και τη συμβατότητα του ρυθμιστικού που εμπλέκεται στην άμεση αντίδραση PCR.

Αν και υπάρχουν λίγο πολύ αναστολείς PCR σε κοινά δείγματα, η άμεση PCR μπορεί να επιτύχει αξιόπιστη ενίσχυση υπό τη δράση ενζύμων και ρυθμιστικών διαλυμάτων.Η παραδοσιακή αντίδραση PCR απαιτεί νουκλεϊκό οξύ υψηλής ποιότητας ως εκμαγείο, το οποίο μπορεί να αναστείλει την ομαλή πρόοδο της αντίδρασης PCR εάν το εκμαγείο περιέχει πρωτεΐνες και άλλες ακαθαρσίες.Η άμεση PCR είναι σήμερα μια από τις πιο δημοφιλείς τεχνολογίες στον τομέα της μοριακής διάγνωσης.

01 Η Direct PCR χρησιμοποιήθηκε αρχικά για ζώα και φυτά

Η πιο πρώιμη εφαρμογή της άμεσης PCR είναι στον τομέα των ζώων και των φυτών, όπως το αίμα, ο ιστός και τα μαλλιά αρουραίου, γάτας, κοτόπουλου, κουνελιού, προβάτων, βοοειδών κ.λπ., φύλλων και σπόρων φυτών κ.λπ., που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη γονότυπου, διαγονιδιακών, ανίχνευσης πλασμιδίων, ανάλυση γονιδιακής νοκ-άουτ, ανάλυση πηγής DNA και ταυτοποίηση άλλων ειδών.

Αυτά τα πεδία έχουν κάποια κοινά χαρακτηριστικά, δηλαδή το περιεχόμενο γονιδίου στόχου είναι σχετικά υψηλό και η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος είναι ενοχλητική, επομένως η άμεση PCR μπορεί όχι μόνο να εξοικονομήσει χρόνο και να έχει μικρό αντίκτυπο στα αποτελέσματα, αλλά και να εξοικονομήσει κόστος.

Η άμεση PCR που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση παθογόνων είναι θέμα των τελευταίων ετών, ορισμένοι κατασκευαστές αντιδραστηρίων PCR έχουν κάνει πολλές προσπάθειες προς αυτή την κατεύθυνση όταν κάνουν καινοτομίες.Ειδικά σε αυτήν την επιδημία COVID-19, πολλά τέτοια προϊόντα ανίχνευσης έχουν εμφανιστεί στην αγορά, όπως το κιτ ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων SARS-CoV-2 (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) που ερευνήθηκε και αναπτύχθηκε από την Foregene, η οποία χρησιμοποιεί τεχνολογία RT PCR σε πραγματικό χρόνο (rRT-PCR) για ποιοτική ανίχνευση ρινικού οξέος SARS-CoV-2 αλ δείγματα επιχρίσματος.

Η Foregene είναι μία από τις εταιρείες που χρησιμοποιούν τεχνολογία Direct PCR, για την ανίχνευση φυσιολογικών ORF1ab, N, E καιπαραλαγή κατατάσσει νουκλεϊκά οξέα σε δείγματα ανθρώπινου ρινοφαρυγγικού ή στοματοφαρυγγικού επιχρίσματος όπως SARS-CoV-2 B.1.1.7 lineage (UK), B.1.351 lineage (ZA), B.1.617 lineage (IND) και P.1 lineage (BR).

02  Αντιδραστήρια που απαιτούνται για άμεση PCR

Δείγμα λύσης

Το δείγμα λύματος μπορεί να διαμορφωθεί μόνοι σας ή να αγοραστεί.Η διαφορά στη σύνθεση διαφορετικών εμπορικών προϊόντων λύσης θα κάνει την ικανότητα λύσης διαφορετική και στη συνέχεια ο χρόνος λύσης θα είναι ελαφρώς διαφορετικός.Για παράδειγμα, για την παρασκευή δειγμάτων ζωικού ιστού, συνιστάται γενικά 30 λεπτά ή ολονύκτια λύση και το διάλυμα λύσης για ιούς κυμαίνεται από 3-10 λεπτά.

Κύριο μείγμα PCR

Συνιστάται η χρήση πολυμεράσης DNA θερμής εκκίνησης για την ενίσχυση της ειδικής ενίσχυσης και την αύξηση της ικανότητας ενίσχυσης.Ο πυρήνας της άμεσης PCR είναι μια πολύ ανεκτική πολυμεράση.

Εξάλειψη ή αναστολή συστατικών στο δείγμα που επηρεάζουν την ενίσχυση του DNA

Μετά την επεξεργασία του δείγματος με το προϊόν λύσης, πρωτεΐνες, λιπίδια και άλλα κυτταρικά υπολείμματα θα απελευθερωθούν, αυτές οι ουσίες θα αναστείλουν την αντίδραση PCR.Επομένως, η άμεση PCR απαιτεί την προσθήκη αντίστοιχης αφαίρεσης ή αναστολέων για να μειωθεί η επίδραση αυτών των παραγόντων.

03  Μια συλλογή από πέντε σημεία γνώσης της άμεσης PCR

Πρώτον, η τεχνολογία Direct PCR είναι μια τεχνολογία άμεσης PCR για διάφορα βιολογικά δείγματα.Κάτω από αυτήν την τεχνική συνθήκη, δεν υπάρχει ανάγκη διαχωρισμού και εκχύλισης του νουκλεϊκού οξέος, άμεσης χρήσης του δείγματος ιστού ως αντικειμένου και προσθήκης των εκκινητών γονιδίου στόχου για την εκτέλεση της αντίδρασης PCR.

Δεύτερον, η τεχνολογία Direct PCR δεν είναι μόνο μια παραδοσιακή τεχνολογία ενίσχυσης προτύπου DNA, αλλά περιλαμβάνει επίσης PCR αντίστροφης μεταγραφής προτύπου RNA.

Τρίτον, η τεχνολογία Direct PCR όχι μόνο εκτελεί άμεσα τυπικές ποιοτικές αντιδράσεις PCR σε δείγματα ιστών, αλλά περιλαμβάνει επίσης αντιδράσεις qPCR σε πραγματικό χρόνο, κάτι που απαιτεί από το σύστημα αντίδρασης να έχει ισχυρή ικανότητα παρεμβολής φθορισμού κατά του υποβάθρου και ο ενδογενής φθορισμός σβήνει την ανταγωνιστική ικανότητα.

Τέταρτον, τα δείγματα που στοχεύουν η τεχνολογία Direct PCR χρειάζονται μόνο την απελευθέρωση προτύπων νουκλεϊκού οξέος και δεν αφαιρούν πρωτεΐνες, πολυσακχαρίτες, ιόντα άλατος κ.λπ. που παρεμβαίνουν στην αντίδραση PCR.Πράγμα που απαιτεί η πολυμεράση νουκλεϊκού οξέος και το μίγμα PCR στο σύστημα αντίδρασης να έχουν εξαιρετική αντίσταση και προσαρμοστικότητα για να εξασφαλιστεί η ενζυμική δραστηριότητα και η ακρίβεια αντιγραφής υπό πολύπλοκες συνθήκες.

Πέμπτον, το δείγμα ιστού που στοχεύει η τεχνολογία Direct PCR χωρίς καμία επεξεργασία εμπλουτισμού νουκλεϊκού οξέος και η ποσότητα του εκμαγείου είναι πολύ μικρή, γεγονός που απαιτεί το σύστημα αντίδρασης να έχει εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία και αποτελεσματικότητα ενίσχυσης.