Το εξαιρετικό χαρακτηριστικό της αντίδρασης PCR είναι η μεγάλη ικανότητα ενίσχυσης και η εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία της.Προκειμένου να βελτιώσουμε την απόδοση της PCR και την αποτελεσματικότητα ανίχνευσης, δεσμευόμαστε να βελτιώσουμε την ικανότητα ενίσχυσης PCR και την ευαισθησία ανίχνευσης, αλλά ο πονοκέφαλος βρίσκεται στη διαδικασία του πειράματος.Συχνά εμφανίζονται ψευδώς θετικά και μια πολύ μικρή ποσότητα διασταυρούμενης μόλυνσης δείγματος ή μόλυνσης προϊόντος PCR μπορεί να προκαλέσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα στο πείραμα.
Πέντε τύποι μόλυνσης προϊόντος PCR
Υπάρχουν πολλοί λόγοι μόλυνσης με PCR, οι οποίοι μπορούν να χωριστούν χονδρικά στις ακόλουθες κατηγορίες:
Η μόλυνση του δείγματος προκαλείται κυρίως από τη μόλυνση του δοχείου για τη συλλογή του δείγματος ή όταν το δείγμα τοποθετείται, διαρρέει από το δοχείο λόγω χαλαρής σφράγισης ή το δείγμα έχει προσκολληθεί στο εξωτερικό του δοχείου, γεγονός που προκαλεί διασταυρούμενη μόλυνση.Η μόλυνση οδηγεί σε μόλυνση μεταξύ των δειγμάτων.ορισμένα μικροβιακά δείγματα, ειδικά οι ιοί, μπορούν να εξαπλωθούν με αερολύματα ή να σχηματίσουν αερολύματα, με αποτέλεσμα την αμοιβαία μόλυνση.
Ο κύριος λόγος είναι ότι κατά την παρασκευή των αντιδραστηρίων PCR, το πιστόλι δειγμάτων, το δοχείο, το διπλά απεσταγμένο νερό και άλλα διαλύματα μολύνονται από το πρότυπο νουκλεϊκού οξέος PCR.
Σε εργαστήρια μοριακής βιολογίας και σε ορισμένα εργαστήρια που χρησιμοποιούν κλωνοποιημένα πλασμίδια ως θετικούς μάρτυρες, το πρόβλημα της μόλυνσης από κλωνοποιημένα πλασμίδια είναι επίσης κοινό.Επειδή η περιεκτικότητα του πλασμιδίου κλωνοποίησης σε όγκο μονάδας είναι αρκετά υψηλή και χρειάζονται περισσότερα εργαλεία και αντιδραστήρια στη διαδικασία καθαρισμού και το πλασμίδιο σε ζωντανά κύτταρα είναι πολύ πιθανό να μολυνθεί λόγω της ισχυρής ικανότητας ανάπτυξης και αναπαραγωγής των ζωντανών κυττάρων.
Η μόλυνση των ενισχυμένων προϊόντων είναι το πιο κοινό πρόβλημα μόλυνσης στις αντιδράσεις PCR.Επειδή η ποσότητα αντιγράφων του προϊόντος PCR είναι μεγάλη (γενικά 1013 αντίγραφα/ml), η οποία είναι πολύ μεγαλύτερη από το όριο του αριθμού αντιγράφων ανίχνευσης PCR, μια πολύ μικρή ποσότητα μόλυνσης του προϊόντος PCR μπορεί να προκαλέσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα.
Η ρύπανση από αεροζόλ είναι η πιο πιθανή μορφή μόλυνσης των προϊόντων PCR, και είναι επίσης η πιο εύκολη να παραβλεφθεί.Σχηματίζεται από την τριβή μεταξύ της υγρής επιφάνειας και του αέρα.Γενικά, μπορεί να σχηματιστεί μόλυνση από αεροζόλ όταν ανοίγει το καπάκι, όταν το δείγμα αναρροφάται ή ακόμα και όταν ο σωλήνας αντίδρασης ανακινείται έντονα.Σύμφωνα με υπολογισμούς, ένα σωματίδιο αερολύματος μπορεί να περιέχει 48.000 αντίγραφα, επομένως η ρύπανση που προκαλείται από αυτό είναι ένα πρόβλημα που αξίζει ιδιαίτερης προσοχής.
Συγκεκριμένα, τα εργαστήρια δοκιμών χρησιμοποιούν συχνά το ίδιο ζεύγος εκκινητών για να ελέγξουν ένα συγκεκριμένο γονίδιο.Με την πάροδο του χρόνου, θα εμφανιστεί μεγάλη ποσότητα μόλυνσης του προϊόντος PCR στον εργαστηριακό χώρο.Μόλις συμβεί μια τέτοια μόλυνση, είναι δύσκολο να εξαλειφθεί σε σύντομο χρονικό διάστημα.
Για τους τρεις πρώτους τύπους ρύπανσης, μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε αποτελεσματικά μέσα για την αποφυγή, αλλά η ρύπανση που προκαλείται από τα προϊόντα PCR είναι δύσκολο να αποφευχθεί, ειδικά στην κατασκευή μη τυποποιημένων εργαστηρίων PCR.Στη διαδικασία PCR, όταν το άκρο της πιπέτας απορροφά και φυσά το υγρό, και το κάλυμμα του σωλήνα PCR ανοίγει, θα σχηματιστεί ένα αεροζόλ.Τα μόρια DNA που μεταφέρονται από το αεροζόλ (ένα αεροζόλ μπορεί να μεταφέρει δεκάδες χιλιάδες DNA) είναι δύσκολο να εξαλειφθούν επειδή επιπλέουν στον αέρα.Μόλις εισαχθεί ο επόμενος γύρος πειραμάτων PCR, αναπόφευκτα θα προκύψουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα.
Όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα, ο αρνητικός έλεγχος ενίσχυσε επίσης την αντίστοιχη ζώνη ενδιαφέροντος:
Το πρώτο μέρος αυτού του τεύχους σχετικά με τη ρύπανση και την πρόληψη PCR παρουσιάζεται εδώ.Το επόμενο τεύχος θα σας μεταφέρει το δεύτερο μέρος «Πρόληψη μόλυνσης προϊόντων PCR», οπότε μείνετε συντονισμένοι!
Ώρα ανάρτησης: Ιουλ-25-2017
