Στα πειράματα qPCR, ο σχεδιασμός εκκινητών είναι επίσης ένας πολύ σημαντικός σύνδεσμος.Το εάν οι εκκινητές είναι κατάλληλοι ή όχι σχετίζεται στενά με το εάν η απόδοση ενίσχυσης φτάνει το πρότυπο, εάν τα ενισχυμένα προϊόντα είναι ειδικά και εάν τα πειραματικά αποτελέσματα είναι διαθέσιμα.
Πώς λοιπόν να βελτιώσετε την ειδικότητα του εκκινητή qPCR;Υψηλή απόδοση ενίσχυσης;
Σήμερα, θα σας οδηγήσουμε να σχεδιάσετε από κοινού εκκινητές qPCR και αφήστε το σχέδιο εκκινητών qPCR να γίνει μια αποτελεσματική δεξιοτεχνία στα πειράματα.
Όταν σχεδιάζετε εκκινητές qPCR, συνήθως προσέχετε τα ακόλουθα σημεία: οι εκκινητές πρέπει να σχεδιάζονται κατά μήκος εσώνων όσο το δυνατόν περισσότερο, το μήκος του προϊόντος πρέπει να είναι 100-300 bp, η τιμή Tm να είναι όσο το δυνατόν πιο κοντά στους 60°C και τα ανάντη και κατάντη εκκινητές πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πιο κοντά και το τέλος του ασταριού πρέπει να περιμένει G ή C κ.λπ.
1. Σχεδιασμός εκκινητών που καλύπτουν εσώνια
Κατά το σχεδιασμό εκκινητών qPCR, η επιλογή εκκινητών σχεδιασμένων κατά μήκος εσωνίων μπορεί να αποτρέψει την ενίσχυση του εκμαγείου gDNA και όλα τα προϊόντα προέρχονται από την ενίσχυση του cDNA, εξαλείφοντας έτσι την επίδραση της μόλυνσης από gDNA.
2. Μήκος ασταριού
Το μήκος του εκκινητή είναι γενικά μεταξύ 18-30 nt και το μήκος του προϊόντος ενίσχυσης θα πρέπει να ελέγχεται μεταξύ 100-300 bp όσο το δυνατόν περισσότερο.
Εάν το αστάρι είναι πολύ κοντό, θα οδηγήσει σε μη ειδική ενίσχυση, και εάν είναι πολύ μακρύ, θα σχηματίσει εύκολα δευτερεύουσα δομή (όπως δομή φουρκέτας).Εάν το προϊόν ενίσχυσης είναι πολύ μακρύ, δεν είναι κατάλληλο για την αντίδραση πολυμεράσης, η οποία θα επηρεάσει την αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης PCR.
3. Περιεχόμενο GC και τιμή Tm
Η περιεκτικότητα σε GC των εκκινητών θα πρέπει να ελέγχεται μεταξύ 40% και 60%.Εάν είναι πολύ υψηλό ή πολύ χαμηλό, δεν είναι ευνοϊκό για την έναρξη της αντίδρασης.Η περιεκτικότητα σε GC των μπροστινών και αντίστροφων εκκινητών θα πρέπει να είναι κοντά στο ίδιο προκειμένου να ληφθεί η ίδια τιμή Tm και θερμοκρασία ανόπτησης.
Η τιμή Tm θα πρέπει να είναι μεταξύ 55-65°C όσο το δυνατόν περισσότερο, γενικά γύρω στους 60°C, και η τιμή Tm του ανάντη και του κατάντη θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πιο κοντά, κατά προτίμηση όχι μεγαλύτερη από 4°C.
4. Αποφύγετε την επιλογή Α στο 3′ άκρο του ασταριού
Όταν το άκρο 3' του ασταριού δεν ταιριάζει, υπάρχουν μεγάλες διαφορές στην απόδοση σύνθεσης διαφορετικών βάσεων.Όταν η τελευταία βάση είναι Α, μπορεί επίσης να ξεκινήσει τη σύνθεση αλυσίδων ακόμη και σε περίπτωση ασυμφωνίας, και όταν η τελευταία βάση είναι Τ Όταν , η αποτελεσματικότητα της επαγωγής ασυμφωνίας μειώνεται σημαντικά.Επομένως, προσπαθήστε να αποφύγετε την επιλογή Α στο 3′ άκρο του ασταριού και είναι καλύτερα να επιλέξετε Τ.
Εάν πρόκειται για εκκινητή ανιχνευτή, το άκρο 5' του ανιχνευτή δεν μπορεί να είναι G, επειδή ακόμη και όταν μια μεμονωμένη βάση G είναι συνδεδεμένη με την ομάδα αναφοράς φθορισμού FAM, το G μπορεί επίσης να σβήσει το σήμα φθορισμού που εκπέμπεται από την ομάδα FAM, με αποτέλεσμα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.Εμφανίζομαι.
5. Κατανομή βάσης
Η κατανομή των τεσσάρων βάσεων στον εκκινητή είναι κατά προτίμηση τυχαία, αποφεύγοντας περισσότερα από 3 συνεχόμενα G ή C στο άκρο 3' και περισσότερα από 3 συνεχόμεναΤο G ή το C είναι εύκολο να δημιουργηθεί σύζευξη στην πλούσια σε GC περιοχή ακολουθίας.
6. Η περιοχή σχεδιασμού ασταριού θα πρέπει να αποφεύγει πολύπλοκες δευτερεύουσες δομές.
Η δευτερεύουσα δομή που σχηματίζεται από τον μονό κλώνο του προϊόντος ενίσχυσης θα επηρεάσει την ομαλή πρόοδο της PCR.Προβλέποντας εκ των προτέρων εάν υπάρχει δευτερεύουσα δομή στην αλληλουχία στόχο, προσπαθήστε να αποφύγετε αυτή την περιοχή στο σχεδιασμό των εκκινητών.
7. Οι ίδιοι οι εκκινητές και μεταξύ των εκκινητών θα πρέπει να προσπαθήσουν να αποφύγουν διαδοχικές συμπληρωματικές βάσεις.
Δεν μπορεί να υπάρχει διαδοχική συμπληρωματικότητα 4 βάσεων μεταξύ του ίδιου του ασταριού και του ασταριού.Το ίδιο το αστάρι δεν θα πρέπει να έχει συμπληρωματική σειρά, διαφορετικά θα διπλωθεί για να σχηματίσει μια δομή φουρκέτας, η οποία θα επηρεάσει τον συνδυασμό ανόπτησης του ασταριού και του προτύπου.
Συμπληρωματικές αλληλουχίες δεν μπορούν να υπάρχουν μεταξύ ανοδικών και καθοδικών εκκινητών.Η συμπληρωματικότητα μεταξύ των εκκινητών θα παράγει διμερή εκκινητών, τα οποία θα μειώσουν την αποτελεσματικότητα της PCR και θα επηρεάσουν ακόμη και την ποσοτική ακρίβεια.Εάν οι δομές ασταριού-διμερούς και φουρκέτας είναι αναπόφευκτες, η τιμή △G δεν πρέπει να είναι πολύ υψηλή (θα πρέπει να είναι μικρότερη από 4,5 kcal/mol).
8. Οι εκκινητές ενισχύουν το συγκεκριμένο προϊόν στόχο.
Ο απώτερος στόχος της ανίχνευσης qPCR είναι η κατανόηση της αφθονίας του γονιδίου στόχου.Εάν προκύψει μη ειδική ενίσχυση, η ποσοτικοποίηση θα είναι ανακριβής.Επομένως, αφού σχεδιαστούν οι εκκινητές, πρέπει να ελεγχθούν με BLAST και η ειδικότητα των προϊόντων συγκρίνεται στη βάση δεδομένων αλληλουχιών.
Στη συνέχεια, παίρνουμε το ανθρώπινο γονίδιο GAS6 (Growth stop specific 6) ως παράδειγμα για τον σχεδιασμό εκκινητών qPCR.
01 γονίδιο ερωτήματος
Homo GAS6μέσω του NCBI.Εδώ, θα πρέπει να δώσουμε προσοχή στη σύγκριση του ονόματος γονιδίου και των ειδών για να διασφαλίσουμε ότι είναι συνεπή.
02 Βρείτε τη γονιδιακή αλληλουχία
(1) Εάν η αλληλουχία στόχος είναι γονιδιωματικό DNA, επιλέξτε την πρώτη, η οποία είναι η αλληλουχία γονιδιωματικού DNA του γονιδίου.
(2) Εάν η αλληλουχία στόχος είναι mRNA, επιλέξτε τη δεύτερη.Μετά την εισαγωγή, κάντε κλικ στο «CDS» στον παρακάτω πίνακα.Η αλληλουχία καφέ φόντου είναι η κωδικοποιητική αλληλουχία του γονιδίου.
03 Αστάρια σχεδίασης
Εισαγάγετε τη διεπαφή Primer-BLAST
Εισαγάγετε τον αριθμό αλληλουχίας γονιδίου ή την ακολουθία σε μορφή Fasta επάνω αριστερά και συμπληρώστε τις σχετικές παραμέτρους.

Κάντε κλικ στο «Λήψη εκκινητών» και το NCBI θα εμφανιστεί για να σας πει ότι αυτή η επιλογή παραμέτρων θα ενισχυθεί σε άλλες παραλλαγές ματίσματος.Μπορούμε να ελέγξουμε τις διάφορες παραλλαγές ματίσματος και να τις υποβάλουμε για να πάρουμε το κατάλληλο ζεύγος εκκινητών (όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα ).Αυτή η διαδικασία μπορεί να διαρκέσει δεκάδες δευτερόλεπτα για να εκτελεστεί.
Οι θερμοκρασίες ανόπτησης αυτών των ζευγών ασταριών είναι περίπου 60°C.Σύμφωνα με το σκοπό του πειράματος, επιλέξτε εκκινητές με μέτριο μήκος, καλή ειδικότητα και λιγότερη αυτοσυμπλήρωση των εκκινητών για το πείραμα και το ποσοστό επιτυχίας είναι αρκετά υψηλό!
04Επαλήθευση ειδικότητας εκκινητή
Μάλιστα, εκτός από το σχεδιασμό ασταριών, το Primer-Blast μπορεί να αξιολογήσει και τα αστάρια που σχεδιάσαμε μόνοι μας.Επιστρέψτε στη σελίδα σχεδίασης ασταριού, εισαγάγετε τα upstream και downstream primer που σχεδιάσαμε και άλλες παράμετροι δεν θα προσαρμοστούν.Μετά την υποβολή, μπορείτε να δείτε εάν το ζεύγος των εκκινητών υπάρχει και σε άλλα γονίδια.Εάν όλα αυτά εμφανίζονται στο γονίδιο που θέλουμε να ενισχύσουμε, υποδεικνύοντας ότι η ειδικότητα αυτού του ζεύγους εκκινητών είναι μεγάλη!(Για παράδειγμα, αυτό είναι το μόνο αποτέλεσμα του ερωτήματος εκκινητή!)

05 Ποιοτική κρίση αστάρι
Τι είδους αστάρι είναι το "τέλειο" αστάρι που συνδυάζει "απόδοση ενίσχυσης μέχρι το πρότυπο", "ενισχυμένα χαρακτηριστικά προϊόντος" και "αξιόπιστα πειραματικά αποτελέσματα";
Αποδοτικότητα ενίσχυσης

καμπύλη τήξης
Η απόδοση ενίσχυσης των εκκινητών φτάνει το 90%-110%, που σημαίνει ότι η απόδοση ενίσχυσης είναι καλή, και η καμπύλη τήξης έχει μία μόνο κορυφή και συνήθως Tm>80°C, που σημαίνει ότι η ειδικότητα ενίσχυσης είναι καλή.
 
Σχετικά προϊόντα:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman