Η τεχνολογία μοριακής διάγνωσης χρησιμοποιεί μεθόδους μοριακής βιολογίας για την ανίχνευση της έκφρασης και της δομής του γενετικού υλικού του ανθρώπινου σώματος και διαφόρων παθογόνων παραγόντων, ώστε να επιτευχθεί ο σκοπός της πρόβλεψης και της διάγνωσης ασθενειών.

Τα τελευταία χρόνια, με την αναβάθμιση και την επανάληψη της μοριακής διαγνωστικής τεχνολογίας, η κλινική εφαρμογή της μοριακής διαγνωστικής γίνεται όλο και πιο εκτεταμένη και σε βάθος και η αγορά μοριακών διαγνωστικών έχει εισέλθει σε μια περίοδο ταχείας ανάπτυξης.

Ο συγγραφέας συνοψίζει τις κοινές τεχνολογίες μοριακής διάγνωσης στην αγορά και χωρίζεται σε τρία μέρη: το πρώτο μέρος εισάγει την τεχνολογία PCR, το δεύτερο μέρος την τεχνολογία ισοθερμικής ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος και το δεύτερο μέρος την τεχνολογία προσδιορισμού αλληλουχίας.

01

Μέρος Ι: Τεχνολογία PCR

Τεχνολογία PCR

Η PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) είναι μία από τις in vitro τεχνολογίες ενίσχυσης του DNA, με ιστορικό άνω των 30 ετών.

Η τεχνολογία PCR πρωτοπαρουσιάστηκε το 1983 από τον Kary Mullis από την Cetus των ΗΠΑ.Ο Mullis υπέβαλε αίτηση για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας PCR το 1985 και δημοσίευσε την πρώτη ακαδημαϊκή εργασία PCR για την Επιστήμη την ίδια χρονιά.Ο Mullis κέρδισε το Νόμπελ Χημείας το 1993.

Βασικές Αρχές PCR

Η PCR μπορεί να ενισχύσει τα θραύσματα του DNA στόχου περισσότερο από ένα εκατομμύριο φορές.Η αρχή είναι ότι κάτω από την κατάλυση της DNA πολυμεράσης, ο μητρικός κλώνος DNA χρησιμοποιείται ως εκμαγείο και ένας συγκεκριμένος εκκινητής χρησιμοποιείται ως σημείο εκκίνησης για επέκταση.Αναπαράγεται in vitro μέσω βημάτων όπως η μετουσίωση, η ανόπτηση και η επέκταση.Η διαδικασία του DNA θυγατρικού κλώνου συμπληρωματικού προς το πρότυπο DNA του μητρικού κλώνου.

Η τυπική διαδικασία PCR χωρίζεται σε τρία στάδια:

1. Μετουσίωσης: Χρησιμοποιήστε υψηλή θερμοκρασία για να διαχωρίσετε διπλούς κλώνους DNA.Οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των διπλών κλώνων του DNA σπάνε σε υψηλές θερμοκρασίες (93-98°C).

2. Ανόπτηση: Αφού διαχωριστεί το δίκλωνο DNA, η θερμοκρασία μειώνεται έτσι ώστε ο εκκινητής να μπορεί να συνδεθεί με το μονόκλωνο DNA.

3. Επέκταση: Η πολυμεράση DNA αρχίζει να συνθέτει συμπληρωματικούς κλώνους κατά μήκος των κλώνων DNA από τους εκκινητές που συνδέονται όταν η θερμοκρασία χαμηλώνει.Όταν ολοκληρωθεί η επέκταση, ολοκληρώνεται ένας κύκλος και ο αριθμός των θραυσμάτων DNA διπλασιάζεται.

Αντίστροφα αυτά τα τρία βήματα 25-35 φορές, ο αριθμός των θραυσμάτων DNA θα αυξηθεί εκθετικά.

Η ευρηματικότητα της PCR είναι ότι μπορούν να σχεδιαστούν διαφορετικοί εκκινητές για διαφορετικά γονίδια στόχους, έτσι ώστε τα θραύσματα γονιδίου στόχου να μπορούν να ενισχυθούν σε σύντομο χρονικό διάστημα.

Μέχρι στιγμής, η PCR μπορεί να χωριστεί σε τρεις κατηγορίες, δηλαδή σε συνηθισμένη PCR, φθορίζουσα ποσοτική PCR και ψηφιακή PCR.

Η πρώτη γενιά συνηθισμένης PCR

Χρησιμοποιήστε ένα συνηθισμένο όργανο ενίσχυσης PCR για να ενισχύσετε το γονίδιο στόχο και, στη συνέχεια, χρησιμοποιήστε ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης για να ανιχνεύσετε το προϊόν, μόνο ποιοτική ανάλυση μπορεί να γίνει.

Τα κύρια μειονεκτήματα της πρώτης γενιάς PCR:

- Επιρρεπής σε μη ειδική ενίσχυση και ψευδώς θετικά αποτελέσματα.

-Η ανίχνευση διαρκεί πολύ και η επέμβαση είναι επίπονη.

-Μόνο ποιοτικός έλεγχος μπορεί να γίνει.

Ποσοτική PCR φθορισμού δεύτερης γενιάς

Η ποσοτική PCR φθορισμού (Real-Time PCR), γνωστή και ως qPCR, χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της συσσώρευσης ενισχυμένων προϊόντων μέσω της συσσώρευσης σημάτων φθορισμού προσθέτοντας ανιχνευτές φθορισμού που μπορούν να υποδεικνύουν την πρόοδο του συστήματος αντίδρασης και για να κρίνουν τα αποτελέσματα μέσω της καμπύλης φθορισμού και μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με τη βοήθεια της τιμής καμπύλης C.

Επειδή η τεχνολογία qPCR πραγματοποιείται σε κλειστό σύστημα, η πιθανότητα μόλυνσης μειώνεται και το σήμα φθορισμού μπορεί να παρακολουθηθεί για ποσοτική ανίχνευση, επομένως είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη στην κλινική πράξη και έχει γίνει η κυρίαρχη τεχνολογία στην PCR.

Οι φθορίζουσες ουσίες που χρησιμοποιούνται στην ποσοτική PCR φθορισμού σε πραγματικό χρόνο μπορούν να χωριστούν σε: Φθορίζοντες ανιχνευτές TaqMan, μοριακούς φάρους και φθορίζουσες βαφές.

1) Φθορίζον ανιχνευτή TaqMan:

Κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης PCR, προστίθεται ένας ειδικός ανιχνευτής φθορισμού ενώ προστίθεται ένα ζεύγος εκκινητών.Ο ανιχνευτής είναι ένα ολιγονουκλεοτίδιο και τα δύο άκρα είναι αντίστοιχα επισημασμένα με μια φθορίζουσα ομάδα αναφοράς και μια φθορίζουσα ομάδα σβέσης.

Όταν ο ανιχνευτής είναι άθικτος, το φθορίζον σήμα που εκπέμπεται από την ομάδα αναφοράς απορροφάται από την ομάδα σβέσης.κατά την ενίσχυση PCR, η δραστηριότητα 5'-3' εξωνουκλεάσης του ενζύμου Taq διασπά και αποικοδομεί τον ανιχνευτή, καθιστώντας τη φθορίζουσα ομάδα αναφοράς και σβήνει. Το σήμα φθορισμού συγχρονίζεται πλήρως με το σχηματισμό του προϊόντος PCR.

2) Φθορίζουσες βαφές SYBR:

Στο σύστημα αντίδρασης PCR, προστίθεται περίσσεια φθορίζουσας χρωστικής SYBR.Αφού η φθορίζουσα χρωστική SYBR ενσωματωθεί μη ειδικά στη διπλή έλικα DNA, εκπέμπει ένα φθορίζον σήμα.Το μόριο βαφής SYBR που δεν είναι ενσωματωμένο στην αλυσίδα δεν θα εκπέμπει φθορίζον σήμα, διασφαλίζοντας έτσι το φθορίζον σήμα Η αύξηση των προϊόντων PCR συγχρονίζεται πλήρως με την αύξηση των προϊόντων PCR.Το SYBR συνδέεται μόνο με δίκλωνο DNA, επομένως η καμπύλη τήξης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προσδιοριστεί εάν η αντίδραση PCR είναι ειδική.

3) Μοριακοί φάροι

Είναι ένας ολιγονουκλεοτιδικός ανιχνευτής διπλής επισήμανσης με στελέχη βρόχου που σχηματίζει μια δομή φουρκέτας περίπου 8 βάσεων στα 5 και 3 άκρα.Οι αλληλουχίες νουκλεϊκού οξέος και στα δύο άκρα είναι συμπληρωματικά ζευγαρωμένες, με αποτέλεσμα η ομάδα φθορισμού και η ομάδα σβέσης να είναι σφιχτές.Κλείστε, δεν θα παράγει φθορισμό.

Αφού δημιουργηθεί το προϊόν PCR, κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ανόπτησης, το μεσαίο τμήμα του μοριακού φάρου ζευγαρώνεται με μια συγκεκριμένη αλληλουχία DNA και το φθορίζον γονίδιο διαχωρίζεται από το γονίδιο σβέσης για να παράγει φθορισμό.

Τα κύρια μειονεκτήματα της PCR δεύτερης γενιάς:

Η ευαισθησία εξακολουθεί να λείπει και η ανίχνευση δειγμάτων χαμηλού αντιγράφου δεν είναι ακριβής.

Υπάρχει επιρροή της τιμής του φόντου και το αποτέλεσμα είναι επιρρεπές σε παρεμβολές.

Ψηφιακή PCR τρίτης γενιάς

Η ψηφιακή PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) υπολογίζει τον αριθμό αντιγράφων της αλληλουχίας στόχου μέσω της ανίχνευσης τελικού σημείου και μπορεί να εκτελέσει ακριβή απόλυτη ποσοτική ανίχνευση χωρίς τη χρήση εσωτερικών ελέγχων και τυπικών καμπυλών.

Η ψηφιακή PCR χρησιμοποιεί ανίχνευση τελικού σημείου και δεν εξαρτάται από την τιμή Ct (ουδός κύκλου), επομένως η ψηφιακή αντίδραση PCR επηρεάζεται λιγότερο από την αποτελεσματικότητα ενίσχυσης και η ανοχή στους αναστολείς αντίδρασης PCR βελτιώνεται, με υψηλή ακρίβεια και αναπαραγωγιμότητα.

Λόγω των χαρακτηριστικών της υψηλής ευαισθησίας και της υψηλής ακρίβειας, δεν παρεμβάλλεται εύκολα από αναστολείς αντίδρασης PCR και μπορεί να επιτύχει πραγματική απόλυτη ποσοτικοποίηση χωρίς τυποποιημένα προϊόντα, που έχει γίνει hotspot έρευνας και εφαρμογής.

Ανάλογα με τις διαφορετικές μορφές της μονάδας αντίδρασης, μπορεί να χωριστεί σε τρεις τύπους: μικρορευστοποιητικά, τσιπ και συστήματα σταγονιδίων.