Η απώλεια ακοής (HL) είναι η πιο κοινή ασθένεια αισθητηριακής αναπηρίας στους ανθρώπους.Στις ανεπτυγμένες χώρες, περίπου το 80% των περιπτώσεων προγλωσσικής κώφωσης στα παιδιά προκαλούνται από γενετικούς παράγοντες.Τα πιο συνηθισμένα είναι ελαττώματα ενός γονιδίου (όπως φαίνεται στο Σχ. 1), 124 γονιδιακές μεταλλάξεις έχουν βρεθεί ότι σχετίζονται με μη συνδρομική απώλεια ακοής στον άνθρωπο, ενώ οι υπόλοιπες προκαλούνται από περιβαλλοντικούς παράγοντες.Ένα κοχλιακό εμφύτευμα (μια ηλεκτρονική συσκευή τοποθετημένη στο εσωτερικό αυτί που παρέχει ηλεκτρική διέγερση απευθείας στο ακουστικό νεύρο) είναι μακράν η πιο αποτελεσματική επιλογή για τη θεραπεία της σοβαρής HL, ενώ ένα ακουστικό βαρηκοΐας (μια εξωτερική ηλεκτρονική συσκευή που μετατρέπει και ενισχύει τα ηχητικά κύματα) μπορεί να βοηθήσει ασθενείς με μέτρια HL.Ωστόσο, επί του παρόντος δεν υπάρχουν διαθέσιμα φάρμακα για τη θεραπεία της κληρονομικής HL (GHL).Τα τελευταία χρόνια, η γονιδιακή θεραπεία έχει λάβει αυξανόμενη προσοχή ως μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη θεραπεία της δυσλειτουργίας του εσωτερικού αυτιού.

Εικ1.Κατανομή του τύπου παραλλαγής που σχετίζεται με την κώφωση.[1]

Πρόσφατα, επιστήμονες από το Ινστιτούτο Salk και το Πανεπιστήμιο του Σέφιλντ δημοσίευσαν ένα ερευνητικό αποτέλεσμα στο Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], το οποίο έδειξε ευρείες προοπτικές εφαρμογής για in vivo γονιδιακή θεραπεία της κληρονομικής κώφωσης.Ο Uri Manor, επίκουρος καθηγητής έρευνας στο Ινστιτούτο Salk και διευθυντής του Waitt Center for Advanced Biophotonics, είπε ότι γεννήθηκε με σοβαρή απώλεια ακοής και ένιωθε ότι η αποκατάσταση της ακοής θα ήταν ένα υπέροχο δώρο.Η προηγούμενη έρευνά του διαπίστωσε ότι το Eps8 είναι μια ρυθμιστική πρωτεΐνη ακτίνης με δραστηριότητες δέσμευσης και κάλυψης ακτίνης.στα κοχλιακά τριχωτά κύτταρα, το πρωτεϊνικό σύμπλεγμα που σχηματίζεται από το Eps8 με τα MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 και GNAI3 υπάρχει κυρίως στις περισσότερες.Επομένως, το Eps8 μπορεί να ρυθμίσει το μήκος των στερεοκιλίων των τριχωτών κυττάρων, το οποίο είναι απαραίτητο για τη φυσιολογική λειτουργία της ακοής.Η διαγραφή ή η μετάλλαξη του Eps8 θα οδηγήσει σε βραχεία στερεοκίλια, τα οποία το καθιστούν ανίκανο να μετατρέψει σωστά τον ήχο σε ηλεκτρικά σήματα για την αντίληψη του εγκεφάλου, κάτι που με τη σειρά του οδηγεί σε κώφωση..Την ίδια στιγμή, ο συνεργάτης Walter Marcotti, καθηγητής στο Πανεπιστήμιο του Σέφιλντ, διαπίστωσε ότι τα τριχωτά κύτταρα δεν μπορούν να αναπτυχθούν φυσιολογικά απουσία Eps8.Σε αυτή τη μελέτη, η Manor και ο Marcotti συνεργάστηκαν για να διερευνήσουν εάν η προσθήκη Eps8 σε στερεογόνα κύτταρα θα μπορούσε να αποκαταστήσει τη λειτουργία τους και, με τη σειρά της, να βελτιώσει την ακοή σε ποντίκια.Η ερευνητική ομάδα χρησιμοποίησε τον φορέα αδενο-σχετιζόμενου ιού (AAV) Anc80L65 για να παραδώσει την κωδικοποιητική αλληλουχία που περιέχει άγριου τύπου EPS8 στον κοχλία νεογέννητων ποντικών P1-P2 Eps8-/- με έγχυση με στρογγυλή μεμβράνη παραθύρου.σε κοχλιακά τριχωτά κύτταρα ποντικού Η λειτουργία των στερεοκηλίων επιδιορθώθηκε πριν ωριμάσουν.και το αποτέλεσμα επιδιόρθωσης χαρακτηρίστηκε από τεχνολογία απεικόνισης και μέτρηση στερεοκιλίων.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το Eps8 αύξησε το μήκος των στερεοκιλίων και αποκατέστησε τη λειτουργία των τριχωτών κυττάρων σε κύτταρα χαμηλής συχνότητας.Διαπίστωσαν επίσης ότι, με την πάροδο του χρόνου, τα κύτταρα έμοιαζαν να χάνουν την ικανότητά τους να σωθούν από αυτή τη γονιδιακή θεραπεία.Το συμπέρασμα είναι ότι αυτή η θεραπεία μπορεί να χρειαστεί να χορηγηθεί in utero, καθώς τα τριχωτά κύτταρα Eps8-/- μπορεί να έχουν ωριμάσει ή να έχουν συσσωρεύσει βλάβη που δεν επισκευάζεται μετά τη γέννηση των ποντικών.«Το Eps8 είναι μια πρωτεΐνη με πολλές διαφορετικές λειτουργίες και υπάρχουν ακόμα πολλά να εξερευνήσουμε», είπε η Manor.Η μελλοντική έρευνα θα περιλαμβάνει τη διερεύνηση της επίδρασης της γονιδιακής θεραπείας Eps8 στην αποκατάσταση της ακοής σε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια και εάν μπορεί να είναι δυνατή η παράταση των ευκαιριών θεραπείας.Συμπτωματικά, τον Νοέμβριο του 2020, ο καθηγητής KarenB Avraham του Πανεπιστημίου του Τελ Αβίβ στο Ισραήλ δημοσίευσε τα αποτελέσματά του στο περιοδικό EMBO Molecular Medicine [3], χρησιμοποιώντας μια καινοτόμο τεχνολογία γονιδιακής θεραπείας για τη δημιουργία ενός αβλαβούς συνθετικού αδενοειδούς ιού AAV9-PHP.Β, Το γονιδιακό ελάττωμα στα τριχωτά κύτταρα ποντικών Syne4-/- επιδιορθώθηκε με έγχυση ενός ιού που φέρει την κωδικοποιητική αλληλουχία του Syne4 στο εσωτερικό αυτί των ποντικών, επιτρέποντάς του να εισέλθει στα τριχωτά κύτταρα και να απελευθερώσει το μεταφερόμενο γενετικό υλικό, επιτρέποντάς τους να ωριμάσουν και να λειτουργήσουν κανονικά (όπως στο Σχ. 2).

Εικ2.Σχηματική αναπαράσταση της ανατομίας του εσωτερικού αυτιού, με έμφαση στο όργανο του Corti και την κυτταρική λειτουργία της nesprin-4.

Μπορεί να φανεί ότι η χρήση γονιδιακής θεραπείας για την επίτευξη του σκοπού της θεραπείας κληρονομικών ασθενειών σε επίπεδο γονιδίου με την εισαγωγή, αφαίρεση ή διόρθωση οποιωνδήποτε μεταλλαγμένων γονιδίων για θεραπεία (δηλαδή τον έλεγχο των γενετικών αλλαγών στη νόσο) έχει υψηλό κλινικό αποτέλεσμα.προοπτικές εφαρμογής.Οι τρέχουσες μέθοδοι γονιδιακής θεραπείας για γενετικά ανεπαρκή κώφωση μπορούν να χωριστούν στις ακόλουθες κατηγορίες:

γονιδιακή αντικατάσταση

Η γονιδιακή αντικατάσταση είναι αναμφισβήτητα η πιο «απλή» μορφή γονιδιακής θεραπείας, που βασίζεται στον εντοπισμό και την αντικατάσταση ενός ελαττωματικού γονιδίου με ένα κανονικό ή άγριου τύπου αντίγραφο του γονιδίου.Πρώτη επιτυχής μελέτη γονιδιακής θεραπείας εσωτερικού αυτιού για απώλεια ακοής που προκαλείται από διαγραφή του γονιδίου 3 (VGLUT3) μεταφορέα φυσαλιδώδους γλουταμικού.Η διαμεσολαβούμενη από το AAV1 παροχή εξωγενούς υπερέκφρασης VGLUT3 σε τριχωτά κύτταρα του εσωτερικού αυτιού (IHCs) μπορεί να οδηγήσει σε παρατεταμένη ανάκτηση της ακοής, μερική ανάκτηση συναπτικής μορφολογίας κορδέλας και σπασμωδικές αποκρίσεις [4].Ωστόσο, στα παραδείγματα που περιλαμβάνουν τις δύο αντικαταστάσεις γονιδίων που χορηγούνται με AAV που περιγράφονται στην εισαγωγή παραπάνω, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι τα μοντέλα ποντικών που χρησιμοποιούνται για ορισμένους τύπους διαταραχών κληρονομικής απώλειας ακοής με διαγραφή γονιδίων διαφέρουν προσωρινά από τους ανθρώπους και σε ποντίκια P1, το εσωτερικό αυτί βρίσκεται στο ώριμο στάδιο ανάπτυξης.Αντίθετα, οι άνθρωποι γεννιούνται με ώριμο εσωτερικό αυτί.Αυτή η διαφορά αποτρέπει την πιθανή εφαρμογή των αποτελεσμάτων του ποντικού στη θεραπεία των διαταραχών της ανθρώπινης κληρονομικής κώφωσης, εκτός εάν χορηγηθεί γονιδιακή θεραπεία σε αυτιά ώριμων ποντικών.

Επεξεργασία γονιδίων: CRISPR/Cas9

Σε σύγκριση με την «αντικατάσταση γονιδίων», η ανάπτυξη της τεχνολογίας γονιδιακής επεξεργασίας έχει φέρει την αυγή της θεραπείας γενετικών ασθενειών από τη ρίζα.Είναι σημαντικό ότι η μέθοδος γονιδιακής επεξεργασίας καλύπτει τις ελλείψεις των παραδοσιακών μεθόδων γονιδιακής θεραπείας υπερέκφρασης που δεν είναι κατάλληλες για κυρίαρχες κληρονομικές ασθένειες κώφωσης και το πρόβλημα ότι η μέθοδος υπερέκφρασης δεν διαρκεί πολύ.Αφού οι Κινέζοι ερευνητές κατέκλυσαν ειδικά το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο Myo6C442Y σε ποντίκια Myo6WT/C442Y χρησιμοποιώντας το σύστημα επεξεργασίας γονιδίων AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2, και εντός 5 μηνών από το νοκ-άουτ, ποντίκια Η ακουστική λειτουργία του μοντέλου αποκαταστάθηκε.Ταυτόχρονα, παρατηρήθηκε επίσης ότι το ποσοστό επιβίωσης των τριχωτών κυττάρων στο εσωτερικό αυτί βελτιώθηκε, το σχήμα των βλεφαρίδων έγινε κανονικό και οι ηλεκτροφυσιολογικοί δείκτες διορθώθηκαν [5].Αυτή είναι η πρώτη μελέτη στον κόσμο που χρησιμοποιεί την τεχνολογία CRISPR/Cas9 για τη θεραπεία της κληρονομικής κώφωσης που προκαλείται από μετάλλαξη του γονιδίου Myo6 και είναι μια σημαντική ερευνητική πρόοδος της τεχνολογίας επεξεργασίας γονιδίων για τη θεραπεία της κληρονομικής κώφωσης.Η κλινική μετάφραση της θεραπείας παρέχει μια σταθερή επιστημονική βάση.

Μέθοδοι χορήγησης γονιδιακής θεραπείας

Για να είναι επιτυχής η γονιδιακή θεραπεία, τα γυμνά μόρια DNA δεν μπορούν να διεισδύσουν αποτελεσματικά στα κύτταρα λόγω της υδροφιλίας τους και του αρνητικού φορτίου των φωσφορικών ομάδων και για να εξασφαλιστεί η ακεραιότητα των συμπληρωμένων μορίων νουκλεϊκού οξέος, πρέπει να επιλεγεί μια ασφαλής και αποτελεσματική μέθοδος.Το συμπληρωμένο DNA παραδίδεται στο κύτταρο ή τον ιστό-στόχο.Το AAV χρησιμοποιείται ευρέως ως φορέας χορήγησης για τη θεραπεία ασθενειών λόγω της υψηλής μολυσματικής του δράσης, της χαμηλής ανοσογονικότητας και του ευρέος τροπισμού σε διάφορους τύπους ιστών.Επί του παρόντος, ένας μεγάλος όγκος ερευνητικών εργασιών έχει καθορίσει τον τροπισμό διαφορετικών υποτύπων AAV σε σχέση με διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους στον κοχλία ποντικού.Η χρήση χαρακτηριστικών απελευθέρωσης AAV σε συνδυασμό με κυτταροειδικούς προαγωγείς μπορεί να επιτύχει ειδική κυτταρική έκφραση, η οποία μπορεί να μειώσει τα αποτελέσματα εκτός στόχου.Επιπλέον, ως εναλλακτική λύση στους παραδοσιακούς φορείς AAV, αναπτύσσονται συνεχώς νέοι συνθετικοί φορείς AAV και παρουσιάζουν ανώτερη ικανότητα μεταγωγής στο έσω αυτί, εκ των οποίων ο AAV2/Anc80L65 είναι ο πιο ευρέως χρησιμοποιούμενος.Οι μέθοδοι χορήγησης χωρίς ιούς μπορούν περαιτέρω να χωριστούν σε φυσικές μεθόδους (μικροέγχυση και ηλεκτροδιάτρηση) και χημικές μεθόδους (με βάση τα λιπίδια, με βάση πολυμερή και νανοσωματίδια χρυσού).Και οι δύο προσεγγίσεις έχουν χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία των κληρονομικών διαταραχών κώφωσης και έχουν δείξει διαφορετικά πλεονεκτήματα και περιορισμούς.Εκτός από το όχημα παροχής για γονιδιακή θεραπεία ως όχημα, μπορούν να χρησιμοποιηθούν διαφορετικές προσεγγίσεις για χορήγηση γονιδίου in νίνο με βάση διαφορετικούς τύπους κυττάρων-στόχων, οδούς χορήγησης και θεραπευτική αποτελεσματικότητα.Η περίπλοκη δομή του εσωτερικού αυτιού καθιστά δύσκολη την προσέγγιση των κυττάρων-στόχων και η κατανομή των παραγόντων επεξεργασίας γονιδιώματος είναι αργή.Ο μεμβρανώδης λαβύρινθος βρίσκεται μέσα στον οστέινο λαβύρινθο του κροταφικού οστού και περιλαμβάνει τον κοχλιακό πόρο, τον ημικυκλικό πόρο, τη μήτρα και το μπαλόνι.Η σχετική του απομόνωση, η ελάχιστη λεμφική κυκλοφορία και ο διαχωρισμός του από το αίμα μέσω ενός φράγματος λαβύρινθου αίματος περιορίζουν την αποτελεσματική συστηματική χορήγηση θεραπευτικών φαρμάκων μόνο σε νεογνά ποντίκια.Για να ληφθούν ιικοί τίτλοι κατάλληλοι για γονιδιακή θεραπεία, είναι απαραίτητη η άμεση τοπική έγχυση ιικών φορέων στο εσωτερικό αυτί.Οι καθιερωμένες οδοί ένεσης περιλαμβάνουν [6]: (1) μεμβράνη στρογγυλού παραθύρου (RWM), (2) τραχειοστομία, (3) ενδολεμφική ή περιλεμφική κοχλεοστομία, (4) μεμβράνη στρογγυλού παραθύρου συν οπή σωλήνα (CF) (όπως στο Σχ. 3).

Εικ3.Παροχή γονιδιακής θεραπείας στο εσωτερικό αυτί.

Αν και έχουν γίνει πολλές πρόοδοι στη γονιδιακή θεραπεία, με βάση τους κλινικούς μεταφραστικούς στόχους, χρειάζεται περισσότερη δουλειά για να γίνει η γονιδιακή θεραπεία πρώτης γραμμής θεραπευτική επιλογή για ασθενείς με γενετικές ασθένειες, ειδικά στην ανάπτυξη ασφαλών και αποτελεσματικών φορέων και μεθόδου χορήγησης.Αλλά πιστεύουμε ότι στο εγγύς μέλλον, αυτού του είδους οι θεραπείες θα γίνουν βασικό στοιχείο εξατομικευμένης θεραπείας και θα έχουν εξαιρετικά θετικό αντίκτυπο στη ζωή των ατόμων με γενετικές διαταραχές και στις οικογένειές τους.

Η Foregene κυκλοφόρησε επίσης ένα κιτ διαλογής υψηλής απόδοσης για στοχευμένα γονίδια, το οποίο είναι γρήγορο και μπορεί να εκτελέσει αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής και qPCR χωρίς εξαγωγή RNA.

Σύνδεσμοι προϊόντων

Κιτ Cell Direct RT-qPCR—Taqman/SYBR GREEN I

Για περισσότερες πληροφορίες προϊόντος, επικοινωνήστε με:

overseas@foregene.com