Η τιμή Ct είναι η πιο σημαντική μορφή παρουσίασης αποτελεσμάτων της φθορίζουσας ποσοτικής PCR.Χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό διαφορών γονιδιακής έκφρασης ή αριθμού αντιγράφων γονιδίου.Ποια είναι λοιπόν η τιμή Ct της ποσοτικοποίησης του φθορισμού που θεωρείται λογική;Πώς να εξασφαλίσετε το αποτελεσματικό εύρος της τιμής Ct;
Τι είναι η τιμή Ct;
Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ενίσχυσης qPCR, ο αντίστοιχος αριθμός κύκλων ενίσχυσης (Ουδός Κύκλου) όταν το σήμα φθορισμού του ενισχυμένου προϊόντος φτάσει το καθορισμένο κατώφλι φθορισμού.Το C σημαίνει κύκλος και το T σημαίνει κατώφλι.Με απλά λόγια, η τιμή Ct είναι ο αριθμός των κύκλων που αντιστοιχούν όταν η αρχική ενίσχυση προτύπου φτάσει σε ένα ορισμένο ποσό προϊόντος σε qPCR.Η λεγόμενη «ορισμένη ποσότητα προϊόντος» θα εξηγηθεί περαιτέρω αργότερα.
Τι κάνει η τιμή Ct;
1.Σχέση μεταξύ εκθετικής ενίσχυσης, ποσότητας προτύπου και τιμής Ct
Στην ιδανική περίπτωση, τα γονίδια στο qPCR συσσωρεύονται με εκθετική ενίσχυση μετά από έναν ορισμένο αριθμό κύκλων.Η σχέση μεταξύ του αριθμού των κύκλων ενίσχυσης και της ποσότητας των προϊόντων είναι: Ενισχυμένη ποσότητα προϊόντος = αρχική ποσότητα προτύπου × (1+En) αριθμός κύκλων.Ωστόσο, η αντίδραση qPCR δεν βρίσκεται πάντα σε ιδανική κατάσταση.Όταν η ποσότητα του ενισχυμένου προϊόντος φτάσει σε μια "ορισμένη ποσότητα προϊόντος", ο αριθμός των κύκλων αυτή τη στιγμή είναι η τιμή Ct και βρίσκεται στην περίοδο εκθετικής ενίσχυσης.Η σχέση μεταξύ της τιμής Ct και της ποσότητας του αρχικού προτύπου: Υπάρχει μια γραμμική σχέση μεταξύ της τιμής Ct του προτύπου και του λογάριθμου του αριθμού αντιγράφου έναρξης του προτύπου.Όσο υψηλότερη είναι η αρχική συγκέντρωση του προτύπου, τόσο μικρότερη είναι η τιμή Ct.Όσο χαμηλότερη είναι η αρχική συγκέντρωση του προτύπου, τόσο μεγαλύτερη είναι η τιμή Ct.
2.Καμπύλη ενίσχυσης, κατώφλι φθορισμού και ορισμένη ποσότητα προϊόντος PCR
Η ποσότητα του προϊόντος ενίσχυσης qPCR παρουσιάζεται άμεσα με τη μορφή φθορίζοντος σήματος, δηλαδή της καμπύλης ενίσχυσης.Στο πρώιμο στάδιο της PCR, η ενίσχυση γίνεται υπό ιδανικές συνθήκες, ο αριθμός των κύκλων είναι μικρός, η συσσώρευση προϊόντος είναι μικρή και το επίπεδο φθορισμού δεν μπορεί να διακριθεί σαφώς από το υπόβαθρο φθορισμού.Μετά από αυτό, ο φθορισμός αυξάνεται και εισέρχεται στην εκθετική φάση.Η ποσότητα του προϊόντος PCR μπορεί να ανιχνευθεί σε ένα ορισμένο σημείο όταν η αντίδραση PCR βρίσκεται ακριβώς στην εκθετική φάση, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως «ορισμένη ποσότητα προϊόντος» και το αρχικό περιεχόμενο του προτύπου μπορεί να συναχθεί από αυτό.Επομένως, η ένταση του σήματος φθορισμού που αντιστοιχεί σε μια ορισμένη ποσότητα προϊόντος είναι το κατώφλι φθορισμού.
Στο τελευταίο στάδιο της PCR, η καμπύλη ενίσχυσης δεν εμφανίζει πλέον εκθετική ενίσχυση και εισέρχεται στη γραμμική φάση και στη φάση του οροπεδίου.
3.Αναπαραγωγιμότητα των τιμών Ct
Όταν ο κύκλος PCR φτάσει τον αριθμό κύκλου της τιμής Ct, μόλις εισήγαγε την πραγματική περίοδο εκθετικής ενίσχυσης.Αυτή τη στιγμή, το μικρό σφάλμα δεν έχει ενισχυθεί, επομένως η αναπαραγωγιμότητα της τιμής Ct είναι εξαιρετική, δηλαδή το ίδιο πρότυπο ενισχύεται σε διαφορετικούς χρόνους ή σε διαφορετικούς σωλήνες ταυτόχρονα.Ενίσχυση, η λαμβανόμενη τιμή Ct είναι σταθερή.
1.Απόδοση ενίσχυσης Εν
Η αποτελεσματικότητα ενίσχυσης PCR αναφέρεται στην αποτελεσματικότητα με την οποία η πολυμεράση μετατρέπει το γονίδιο που πρόκειται να ενισχυθεί σε ένα αμπλικόνιο.Η αποτελεσματικότητα ενίσχυσης όταν ένα μόριο DNA μετασχηματίζεται σε δύο μόρια DNA είναι 100%.Η απόδοση ενίσχυσης εκφράζεται συνήθως ως En.Προκειμένου να διευκολυνθεί η ανάλυση των επόμενων άρθρων, εισάγονται εν συντομία οι παράγοντες που επηρεάζουν την απόδοση ενίσχυσης.
| Παράγοντες που επηρεάζουν | εξήγηση | Πώς να κρίνεις; |
| Α. Αναστολείς PCR | 1. Το πρότυπο DNA περιέχει ουσίες που αναστέλλουν την αντίδραση PCR, όπως πρωτεΐνες ή απορρυπαντικά.2. Το cDNA μετά την αντίστροφη μεταγραφή περιέχει υψηλή συγκέντρωση συστατικών αντιδραστηρίου μήτρας RNA ή RT, τα οποία μπορεί επίσης να αναστείλουν την επακόλουθη αντίδραση PCR. | 1. Το εάν υπάρχει ρύπανση μπορεί να κριθεί με τη μέτρηση της αναλογίας των A260/A280 και A260/A230 ή ηλεκτροφόρησης RNA.2. Εάν το cDNA αραιώνεται σύμφωνα με μια ορισμένη αναλογία μετά την αντίστροφη μεταγραφή. |
| Β. Λανθασμένος σχεδιασμός ασταριού | Τα αστάρια δεν ανόπτονται αποτελεσματικά | Ελέγξτε τα αστάρια για αστάρια-διμερή ή φουρκέτες, αναντιστοιχίες και μερικές φορές εκτεινόμενα ιντρονικά σχέδια. |
| Γ. Λανθασμένος σχεδιασμός προγράμματος αντίδρασης PCR | 1. Τα αστάρια δεν μπορούν να ανόπτονται αποτελεσματικά2. Ανεπαρκής απελευθέρωση DNA πολυμεράσης 3. Μειώθηκε η μακροχρόνια δραστηριότητα πολυμεράσης DNA σε υψηλή θερμοκρασία | 1. Η θερμοκρασία ανόπτησης είναι υψηλότερη από την τιμή TM του ασταριού2. Ο χρόνος προ της μετουσίωσης είναι πολύ μικρός 3. Ο χρόνος κάθε σταδίου της διαδικασίας αντίδρασης είναι πολύ μεγάλος |
| Δ. Ανεπαρκής ανάμειξη αντιδραστηρίων ή σφάλματα με πιπέτα | Στο σύστημα αντίδρασης, η τοπική συγκέντρωση των συστατικών της αντίδρασης PCR είναι πολύ υψηλή ή ανομοιόμορφη, με αποτέλεσμα τη μη εκθετική ενίσχυση της ενίσχυσης PCR | |
| Ε. Μήκος Amplicon | Το μήκος του ενισχυτικού είναι πολύ μεγάλο, υπερβαίνει τα 300 bp και η απόδοση ενίσχυσης είναι χαμηλή | Ελέγξτε ότι το μήκος του αμπλικόνιου είναι μεταξύ 80-300 bp |
| ΣΤ. Επίδραση των αντιδραστηρίων qPCR | Η συγκέντρωση της DNA πολυμεράσης στο αντιδραστήριο είναι χαμηλή ή η συγκέντρωση των ιόντων στο ρυθμιστικό δεν είναι βελτιστοποιημένη, με αποτέλεσμα η δραστηριότητα του ενζύμου Taq να μην φτάνει στο μέγιστο | Προσδιορισμός της απόδοσης ενίσχυσης με τυπική καμπύλη |
2.Εύρος τιμών Ct
Οι τιμές Ct κυμαίνονται από 15-35.Εάν η τιμή Ct είναι μικρότερη από 15, θεωρείται ότι η ενίσχυση είναι εντός του εύρους της βασικής περιόδου και δεν έχει επιτευχθεί το κατώφλι φθορισμού.Στην ιδανική περίπτωση, υπάρχει μια γραμμική σχέση μεταξύ της τιμής Ct και του λογάριθμου του αρχικού αριθμού αντιγράφου του προτύπου, δηλαδή της τυπικής καμπύλης.Μέσω της τυπικής καμπύλης, όταν η απόδοση ενίσχυσης είναι 100%, η υπολογισμένη τιμή Ct για τον ποσοτικό προσδιορισμό του αριθμού ενός αντιγράφου του γονιδίου είναι περίπου 35. Εάν είναι μεγαλύτερος από 35, ο αρχικός αριθμός αντιγράφου του προτύπου είναι θεωρητικά μικρότερος από 1, κάτι που μπορεί να θεωρηθεί άνευ σημασίας.
Για διαφορετικές περιοχές Ct γονιδίου, λόγω της διαφοράς στον αριθμό αντιγράφων γονιδίου και στην αποτελεσματικότητα ενίσχυσης στην αρχική ποσότητα προτύπου, είναι απαραίτητο να δημιουργηθεί μια τυπική καμπύλη για το γονίδιο και να υπολογιστεί το εύρος γραμμικής ανίχνευσης του γονιδίου.
3.Επηρεαζόμενοι παράγοντες τιμής Ct
Από τη σχέση μεταξύ του αριθμού των κύκλων ενίσχυσης και της ποσότητας του προϊόντος: ποσότητα ενισχυμένου προϊόντος = ποσότητα αρχικού προτύπου × (1+En) αριθμός κύκλου, μπορεί να φανεί ότι υπό ιδανικές συνθήκες, η ποσότητα του αρχικού προτύπου και το En θα έχουν αρνητικό αντίκτυπο στην τιμή Ct επηρεάζεται.Η διαφορά στην ποιότητα του προτύπου ή στην απόδοση ενίσχυσης θα κάνει την τιμή Ct να είναι πολύ μεγάλη ή πολύ μικρή.
Η τιμή 4.Ct είναι πολύ μεγάλη ή πολύ μικρή
Ώρα δημοσίευσης: Φεβ-22-2023
