Η Real Time PCR, γνωστή και ως ποσοτική PCR ή qPCR, είναι μια μέθοδος για παρακολούθηση και ανάλυση σε πραγματικό χρόνο των προϊόντων ενίσχυσης PCR.
Επειδή η ποσοτική PCR έχει τα πλεονεκτήματα της απλής λειτουργίας, της γρήγορης και εύκολης, υψηλής ευαισθησίας, καλής επαναληψιμότητας και χαμηλού ποσοστού μόλυνσης, χρησιμοποιείται ευρέως σε ιατρικές δοκιμές, αξιολόγηση αποτελεσματικότητας φαρμάκων, έρευνα έκφρασης γονιδίων, διαγονιδιακή έρευνα, ανίχνευση γονιδίων, ανίχνευση παθογόνων, ανίχνευση ζώων και φυτών., δοκιμές τροφίμων και άλλους τομείς.
Επομένως, είτε ασχολείστε με βασική έρευνα στις βιοεπιστήμες είτε υπάλληλοι φαρμακευτικών εταιρειών, κτηνοτροφικών εταιρειών, εταιρειών τροφίμων, ή ακόμα και υπάλληλοι γραφείων επιθεώρησης εισόδου-εξόδου και καραντίνας, τμημάτων περιβαλλοντικής παρακολούθησης, νοσοκομείων και άλλων μονάδων, θα εκτεθείτε περισσότερο ή λιγότερο.

Αρχή της PCR σε πραγματικό χρόνο

Η Real Time PCR είναι μια μέθοδος κατά την οποία προστίθενται φθορίζουσες ουσίες στο σύστημα αντίδρασης PCR και η ένταση του σήματος φθορισμού στη διαδικασία της αντίδρασης PCR παρακολουθείται σε πραγματικό χρόνο από ένα ποσοτικό όργανο PCR και, τέλος, αναλύονται και επεξεργάζονται τα πειραματικά δεδομένα.

【Καμπύλη ενίσχυσης】είναι η καμπύλη που περιγράφει τη δυναμική διαδικασία της PCR.Η καμπύλη ενίσχυσης της PCR δεν είναι στην πραγματικότητα μια τυπική εκθετική καμπύλη, αλλά μια σιγμοειδής καμπύλη.

[Φάση πλατφόρμας καμπύλης ενίσχυσης]Με την αύξηση του αριθμού των κύκλων PCR, την αδρανοποίηση της πολυμεράσης DNA, την εξάντληση των dNTP και των εκκινητών και την αναστολή της αντίδρασης σύνθεσης από το πυροφωσφορικό παραπροϊόν της αντίδρασης κ.λπ., η PCR δεν επεκτείνεται πάντα εκθετικά., και τελικά θα μπει σε ένα οροπέδιο.

[Καμπύλη Εκθετικής Ανάπτυξης Περιοχής Ενίσχυσης]Αν και η φάση του οροπεδίου ποικίλλει πολύ, σε μια ορισμένη περιοχή της περιοχής εκθετικής ανάπτυξης της καμπύλης ενίσχυσης, η επαναληψιμότητα είναι πολύ καλή, κάτι που είναι πολύ σημαντικό για την ποσοτική ανάλυση της PCR.

[Τιμή κατωφλίου και τιμή Ct]Θέτουμε την οριακή τιμή της ανίχνευσης φθορισμού στην κατάλληλη θέση στην περιοχή εκθετικής ανάπτυξης της καμπύλης ενίσχυσης, δηλαδή την τιμή κατωφλίου (Threshold).Η τομή της τιμής κατωφλίου και της καμπύλης ενίσχυσης είναι η τιμή Ct, δηλαδή η τιμή Ct αναφέρεται στον αριθμό των κύκλων (Threshold Cycle) όταν επιτευχθεί η τιμή κατωφλίου.

Το παρακάτω γράφημα δείχνει ξεκάθαρα τη σχέση μεταξύ γραμμής κατωφλίου και καμπύλης ενίσχυσης, κατωφλίου και τιμής Ct.

【Πώς να ποσοτικοποιήσετε;】

Έχει αποδειχθεί από τη μαθηματική θεωρία ότι η τιμή Ct έχει αντίστροφη γραμμική σχέση με τον λογάριθμο του αριθμού των αρχικών προτύπων.Το Real Time PCR παρακολουθεί τα προϊόντα ενίσχυσης PCR σε πραγματικό χρόνο και τα ποσοτικοποιεί κατά τη φάση της εκθετικής ενίσχυσης.

Για κάθε κύκλο PCR, το DNA αυξήθηκε εκθετικά κατά 2 φορές και σύντομα έφτασε σε ένα επίπεδο.

Υποθέτοντας ότι η ποσότητα του αρχικού DNA είναι Α₀ , μετά από n κύκλους, η θεωρητική ποσότητα προϊόντος DNA μπορεί να εκφραστεί ως:

A _n =A ₀ × 2ⁿ

Στη συνέχεια, όσο μεγαλύτερη είναι η αρχική ποσότητα DNA A 0, τόσο πιο γρήγορα η ποσότητα του ενισχυμένου προϊόντος φθάνει την τιμή ανίχνευσης An , και ο αριθμός των κύκλων όταν φτάσει στο An είναι η τιμή Ct.Δηλαδή, όσο μεγαλύτερη είναι η αρχική ποσότητα DNA A 0, τόσο νωρίτερα κορυφώνεται η καμπύλη ενίσχυσης, και αντίστοιχα ο απαιτούμενος αριθμός κύκλων n είναι μικρότερος.

Πραγματοποιούμε βαθμιδωτή αραίωση του προτύπου γνωστής συγκέντρωσης και το χρησιμοποιούμε ως πρότυπο για Real Time PCR, και μια σειρά από καμπύλες ενίσχυσης θα ληφθούν σε ίσα διαστήματα με τη σειρά της αρχικής ποσότητας DNA από περισσότερο σε μικρότερο.Σύμφωνα με τη γραμμική σχέση μεταξύ της τιμής Ct και του λογάριθμου του αριθμού των αρχικών προτύπων, ένα[τυπική καμπύλη] μπορεί να δημιουργηθεί.

Αντικαθιστώντας την τιμή Ct του δείγματος με άγνωστη συγκέντρωση στην τυπική καμπύλη, μπορεί να ληφθεί η αρχική ποσότητα μήτρας του δείγματος με άγνωστη συγκέντρωση, η οποία είναι η ποσοτική αρχή της Real Time PCR.

Μέθοδος ανίχνευσης Real Time PCR

Η PCR σε πραγματικό χρόνο ανιχνεύει προϊόντα ενίσχυσης PCR ανιχνεύοντας την ένταση φθορισμού στο σύστημα αντίδρασης.

Αρχή της μεθόδου ενσωμάτωσης φθορίζουσας βαφής】

Φθορίζουσες βαφές, όπως το TB Green ® , μπορεί να συνδεθεί μη ειδικά με δίκλωνο DNA σε συστήματα PCR και να φθορίσει κατά τη σύνδεση.

Η ένταση φθορισμού στο σύστημα αντίδρασης αυξήθηκε εκθετικά με την αύξηση των κύκλων PCR.Ανιχνεύοντας την ένταση φθορισμού, η ποσότητα της ενίσχυσης του DNA στο σύστημα αντίδρασης μπορεί να παρακολουθηθεί σε πραγματικό χρόνο και στη συνέχεια η ποσότητα του αρχικού εκμαγείου στο δείγμα μπορεί να εκτιμηθεί αντίστροφα.

【Αρχή της μεθόδου ανιχνευτή φθορισμού】

φθορίζον αισθητήραείναι μια αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος με μια φθορίζουσα ομάδα στο 5' άκρο και μια ομάδα απόσβεσης στο 3' άκρο, η οποία μπορεί να συνδεθεί ειδικά με το εκμαγείο.Όταν ο ανιχνευτής είναι άθικτος, ο φθορισμός που εκπέμπεται από το φθοροφόρο σβήνει από την ομάδα σβέσης και δεν μπορεί να φθορίσει.Όταν ο ανιχνευτής αποσυντεθεί, η φθορίζουσα ουσία θα διαχωριστεί και θα εκπέμψει φθορισμό.

Ένας ανιχνευτής φθορισμού προστίθεται στο διάλυμα αντίδρασης PCR.Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ανόπτησης, ο φθορίζων ανιχνευτής θα συνδεθεί στη συγκεκριμένη θέση του προτύπου.Κατά τη διαδικασία επέκτασης, η δραστηριότητα εξωνουκλεάσης 5'→3' του ενζύμου PCR μπορεί να αποσυνθέσει τον φθορίζοντα ανιχνευτή που έχει υβριδοποιηθεί με το εκμαγείο και η φθορίζουσα ουσία διασπάται για να εκπέμψει φθορισμό.Ανιχνεύοντας την ένταση φθορισμού του ανιχνευτή στο σύστημα αντίδρασης, μπορεί να επιτευχθεί ο σκοπός της παρακολούθησης της ποσότητας ενίσχυσης του προϊόντος PCR.

【Επιλογή μεθόδου ανίχνευσης φθορισμού】

Εάν χρησιμοποιείται για τη διάκριση αλληλουχιών με υψηλή ομολογία και την εκτέλεση ανίχνευσης πολυπλεξικής PCR, όπως ανάλυση τύπου SNP, η μέθοδος ανιχνευτή φθορισμού είναι αναντικατάστατη.
Για άλλα πειράματα PCR σε πραγματικό χρόνο, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια απλή, εύκολη και χαμηλού κόστους μέθοδος φθορίζουσας χίμαιρας.

probesΙσχυρή ειδικότητα, ικανή για multiplex PCR

Ελλειψη

Απαιτήσεις υψηλής ειδικότητας για ενίσχυση.

Δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί πολλαπλή PCR Χρειάζεται σχεδιασμός συγκεκριμένων ανιχνευτών, υψηλό κόστος.

μερικές φορές ο σχεδιασμός του ανιχνευτή είναι δύσκολος

Σχετικά προϊόντα: