Δεν υπάρχουν σήματα ενίσχυσης

1.Η Taq DNA Polymerase στο κιτ χάνει τη δραστηριότητά της λόγω ακατάλληλης αποθήκευσης ή λήξης του κιτ.
Σύσταση: Επιβεβαιώστε τις συνθήκες αποθήκευσης του κιτ.προσθέστε ξανά μια κατάλληλη ποσότητα Taq DNA Polymerase στο σύστημα PCR ή αγοράστε ένα νέο κιτ PCR σε πραγματικό χρόνο για σχετικά πειράματα.

2. Υπάρχουν πολλοί αναστολείς της Taq DNA Polymerase στο πρότυπο DNA.
Πρόταση: Καθαρίστε ξανά το πρότυπο ή μειώστε την ποσότητα του προτύπου που χρησιμοποιείται.

3.Η συγκέντρωση Mg2+ δεν είναι κατάλληλη.
Σύσταση: Η συγκέντρωση Mg2+ του 2× Real PCR Mix που παρέχουμε είναι 3,5 mM.Ωστόσο, για ορισμένους ειδικούς εκκινητές και υποδείγματα, η συγκέντρωση Mg2+ μπορεί να είναι υψηλότερη.Επομένως, μπορείτε να προσθέσετε απευθείας MgCl2 για να βελτιστοποιήσετε τη συγκέντρωση Mg2+.Συνιστάται η αύξηση του Mg2+ 0,5 mM κάθε φορά για βελτιστοποίηση.

4.Οι συνθήκες ενίσχυσης PCR δεν είναι κατάλληλες και η αλληλουχία εκκινητών ή η συγκέντρωση είναι ακατάλληλη.
Πρόταση: επιβεβαιώστε την ορθότητα της αλληλουχίας εκκινητών και ο εκκινητής δεν έχει υποβαθμιστεί.Εάν το σήμα ενίσχυσης δεν είναι καλό, προσπαθήστε να μειώσετε τη θερμοκρασία ανόπτησης και να ρυθμίσετε τη συγκέντρωση του εκκινητή κατάλληλα.

5.Η ποσότητα του προτύπου είναι πολύ μικρή ή πολύ μεγάλη.
Σύσταση: Εκτελέστε αραίωση βαθμίδωσης γραμμικοποίησης προτύπου και επιλέξτε τη συγκέντρωση προτύπου με το καλύτερο αποτέλεσμα PCR για πείραμα PCR σε πραγματικό χρόνο.

Το NTC έχει πολύ υψηλή τιμή φθορισμού

1.Μόλυνση από αντιδραστήρια που προκαλείται κατά τη λειτουργία.
Σύσταση: Αντικαταστήστε με νέα αντιδραστήρια για πειράματα PCR σε πραγματικό χρόνο.

2.Παρουσιάστηκε μόλυνση κατά την προετοιμασία του συστήματος αντίδρασης PCR.
Σύσταση: Λάβετε τα απαραίτητα προστατευτικά μέτρα κατά τη λειτουργία, όπως: χρήση γαντιών από λατέξ, χρήση μύτης πιπέτας με φίλτρο κ.λπ.

3. Οι εκκινητές αποικοδομούνται και η αποικοδόμηση των εκκινητών θα προκαλέσει μη ειδική ενίσχυση.
Πρόταση: Χρησιμοποιήστε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για να ανιχνεύσετε εάν οι εκκινητές έχουν υποβαθμιστεί και αντικαταστήστε τους με νέους εκκινητές για πειράματα PCR σε πραγματικό χρόνο.

Διμερές εκκινητή ή μη ειδική ενίσχυση

1.Η συγκέντρωση Mg2+ δεν είναι κατάλληλη.
Σύσταση: Η συγκέντρωση Mg2+ του 2× Real PCR EasyTM Mix που παρέχουμε είναι 3,5 mM.Ωστόσο, για ορισμένους ειδικούς εκκινητές και υποδείγματα, η συγκέντρωση Mg2+ μπορεί να είναι υψηλότερη.Επομένως, μπορείτε να προσθέσετε απευθείας MgCl2 για να βελτιστοποιήσετε τη συγκέντρωση Mg2+.Συνιστάται η αύξηση του Mg2+ 0,5 mM κάθε φορά για βελτιστοποίηση.

2.Η θερμοκρασία ανόπτησης PCR είναι πολύ χαμηλή.
Πρόταση: Αυξήστε τη θερμοκρασία ανόπτησης PCR κατά 1℃ ή 2℃ κάθε φορά.

3.Το προϊόν PCR είναι πολύ μακρύ.
Σύσταση: Το μήκος του προϊόντος PCR σε πραγματικό χρόνο θα πρέπει να είναι μεταξύ 100-150 bp, όχι περισσότερο από 500 bp.

4.Οι εκκινητές αποικοδομούνται, και η αποικοδόμηση των εκκινητών θα οδηγήσει στην εμφάνιση ειδικής ενίσχυσης.
Πρόταση: Χρησιμοποιήστε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για να ανιχνεύσετε εάν οι εκκινητές έχουν υποβαθμιστεί και αντικαταστήστε τους με νέους εκκινητές για πειράματα PCR σε πραγματικό χρόνο.

5.Το σύστημα PCR είναι ακατάλληλο ή το σύστημα είναι πολύ μικρό.
Πρόταση: Το σύστημα αντίδρασης PCR είναι πολύ μικρό και θα προκαλέσει μείωση της ακρίβειας ανίχνευσης.Είναι καλύτερο να χρησιμοποιήσετε το σύστημα αντίδρασης που συνιστάται από το όργανο ποσοτικής PCR για να επαναλάβετε το πείραμα PCR σε πραγματικό χρόνο.

Κακή επαναληψιμότητα ποσοτικών τιμών

1. Το όργανο δυσλειτουργεί.
Πρόταση: Μπορεί να υπάρχουν σφάλματα μεταξύ κάθε οπής PCR του οργάνου, με αποτέλεσμα κακή αναπαραγωγιμότητα κατά τη διαχείριση ή την ανίχνευση θερμοκρασίας.Ελέγξτε σύμφωνα με τις οδηγίες του αντίστοιχου οργάνου.

2.Η καθαρότητα του δείγματος δεν είναι καλή.
Σύσταση: Τα ακάθαρτα δείγματα θα οδηγήσουν σε κακή αναπαραγωγιμότητα του πειράματος, η οποία περιλαμβάνει την καθαρότητα του εκμαγείου και των εκκινητών.Είναι καλύτερο να καθαρίσετε εκ νέου το εκμαγείο και οι εκκινητές καθαρίζονται καλύτερα με SDS-PAGE.

3. Ο χρόνος προετοιμασίας και αποθήκευσης του συστήματος PCR είναι πολύ μεγάλος.
Πρόταση: Χρησιμοποιήστε το σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο για πείραμα PCR αμέσως μετά την προετοιμασία και μην το αφήνετε στην άκρη για πολύ.

4.Οι συνθήκες ενίσχυσης PCR δεν είναι κατάλληλες και η αλληλουχία εκκινητών ή η συγκέντρωση είναι ακατάλληλη.
Πρόταση: επιβεβαιώστε την ορθότητα της αλληλουχίας εκκινητών και ο εκκινητής δεν έχει υποβαθμιστεί.Εάν το σήμα ενίσχυσης δεν είναι καλό, προσπαθήστε να μειώσετε τη θερμοκρασία ανόπτησης και να ρυθμίσετε τη συγκέντρωση του εκκινητή κατάλληλα.

5.Το σύστημα PCR είναι ακατάλληλο ή το σύστημα είναι πολύ μικρό.
Πρόταση: Το σύστημα αντίδρασης PCR είναι πολύ μικρό και θα προκαλέσει μείωση της ακρίβειας ανίχνευσης.Είναι καλύτερο να χρησιμοποιήσετε το σύστημα αντίδρασης που συνιστάται από το όργανο ποσοτικής PCR για να επαναλάβετε το πείραμα PCR σε πραγματικό χρόνο.