Πόσα ξέρεις

Σχετικά με το Νεκχύλιση ουκλεϊκού οξέος

Η αρχή και το τέλος του καθαρού νουκλεϊκού οξέος

Όλα είναι δύσκολα στην αρχή, το καθαρισμένο νουκλεϊκό οξύ είναι το περισσότερο

Έναρξη μοριακών πειραμάτων, για επόμενα πειράματα

Η επιτυχία ή η αποτυχία έχει κρίσιμο αντίκτυπο.

Το φασματοφωτόμετρο UV Trace/ultra-trace προτιμάται από πολλούς επιστημονικούς ερευνητές επειδή μπορεί να ανιχνεύσει τη συγκέντρωση νουκλεϊκού οξέος και τα υπολείμματα ιόντων πρωτεϊνών και αλάτων απλά, γρήγορα και οικονομικά.

Όπως όλοι γνωρίζουμε, A260 σημαίνει τιμή OD απορρόφησης νουκλεϊκού οξέος, A280 σημαίνει τιμή απορρόφησης συγκέντρωσης πρωτεΐνης τιμή OD, A230 σημαίνει τιμή απορρόφησης συγκέντρωσης ιόντων άλατος OD, οπότε το A260 μπορεί να μετατρέψει τη συγκέντρωση νουκλεϊκού οξέος, το A260/280 σημαίνει κατάλοιπο πρωτεΐνης, το A260/230 σημαίνει το υπόλειμμα ιόντων άλατος.συμβατικόςνα πιστέψει ότι μπορεί να εξηγήσει την καθαρότητα του DNA και του RNA σεσε κάποιο βαθμό.Δεν είναι το μόνο πρότυπο για την αναγνώριση της απόδοσης και της καθαρότητας νουκλεϊκού οξέος, χρησιμοποιείται μόνο ως αναφορά και δεν είναι «χρυσό πρότυπο».

Το εγχειρίδιο Thermo Fisher ND-2000 δίνει έμφαση στην αξιοπιστία των αποτελεσμάτων των δοκιμών

Ο λόγος είναι ότι τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τη χρήση ενός μικρο/υπερμικρού φασματοφωτόμετρου UV αντικατοπτρίζουν μόνο την απόδοση και την καθαρότητα του νουκλεϊκού οξέος από το πλάι και υπάρχουν πολλοί παράγοντες που επηρεάζουν (οπτική διαδρομή, όγκος δείγματος, συγκέντρωση δείγματος, τιμή pH, άλλα ιόντα που επηρεάζουν τη μέτρηση απορρόφησης κ.λπ.), η μετρούμενη τιμή OD δεν είναι απαραίτητα ακριβής.Ταυτόχρονα, λόγω της έλλειψης εξειδίκευσης του υλικού προσδιορισμού της τιμής απορρόφησης, το μονόκλωνο DNA, το δίκλωνο DNA, το RNA, τα dNTPs και ορισμένες πρωτεΐνες έχουν κορυφές απορρόφησης σε μήκος κύματος 260 nm και η συγκέντρωση που προσδιορίζεται μόνο από το Α260 δεν είναι απαραίτητα το πραγματικό DNA ή RNA.Η συγκέντρωση, η ακεραιότητα και η υποβάθμισή της δεν μπορούν να κριθούν.

Πώς να κρίνουμε λοιπόν την ποιότητα του καθαρισμένου νουκλεϊκού μας οξέος;Εκτός από τη χρήση μικρο/υπερμικρο φασματοφωτόμετρου UV για ανίχνευση, απαιτούνται επίσης μέθοδοι όπως η ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης για την οπτική απεικόνιση της καθαρότητας και της ακεραιότητας του νουκλεϊκού οξέος και για την ένδειξη της συγκέντρωσης σε ορισμένο βαθμό.Με αυτόν τον τρόπο, η απόδοση νουκλεϊκού οξέος και η καθαρότητα που λαμβάνονται από τα αποτελέσματα ανίχνευσης διαφόρων μεθόδων είναι αξιόπιστα.

Πειραματική σύγκριση γραφημάτων

Το γονιδιωματικό DNA των κυττάρων H1299 εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ εξαγωγής DNA της εταιρείας Α και παρατηρήθηκε σημαντική μόλυνση από ακαθαρσίες, με αποτέλεσμα υψηλές τιμές OD

(Τιμή μέτρησης OD και αντίστοιχο ηλεκτροφερόγραμμα)

Ευρετήριο αξιολόγησης

Υπάρχει ένα «χρυσό πρότυπο» για τη δοκιμή απόδοσης και ποιότητας νουκλεϊκού οξέος;

Από όσο γνωρίζουμε δεν υπάρχει απλή, γρήγορη και φθηνή μέθοδος.Είτε πρόκειται για φασματοφωτόμετρο, ηλεκτροφόρηση γέλης ή φασματομετρία μάζας, όλα αντανακλούν τη συγκέντρωση και την καθαρότητα του νουκλεϊκού οξέος στο διάλυμα από διαφορετικές απόψεις και πρέπει να κριθούν με αναφορά το ένα στο άλλο.

Ο καλύτερος δείκτης αξιολόγησης είναι πάνταη πειραματική εφαρμογή παρακολούθησης.Δεν επηρεάζει την αποτελεσματικότητα της αντίστροφης μεταγραφής και της ενίσχυσης PCR.Η απόκτηση αξιόπιστων προϊόντων ενίσχυσης και τιμών Ct και η απόκτηση πλήρους αλληλουχίας με προσδιορισμό αλληλουχίας είναι επιτυχής εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος.

Συνοψίζοντας, η άποψη της θεωρίας μόνο των αναλογιών θα πρέπει να αμφισβητηθεί από την άποψη της «χρήσης καλών μεταγενέστερων πειραματικών αποτελεσμάτων ως καλών παραμέτρων εξαγωγής»!

Συνιστώμενα κιτ εξαγωγής DNA RNA της Foregene για υψηλή καθαρότητα DNA/RNA:

https://www.foreivd.com/reagent/dna-isolation-series/

https://www.foreivd.com/reagent/rna-isolation-series/