Η PCR είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνολογία ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων και χρησιμοποιείται ευρέως λόγω της ευαισθησίας και της ειδικότητάς της.Ωστόσο, η PCR απαιτεί επαναλαμβανόμενη θερμική μετουσίωση και δεν μπορεί να απαλλαγεί από τους περιορισμούς της στήριξης σε όργανα και εξοπλισμό, γεγονός που περιορίζει την εφαρμογή της στις κλινικές δοκιμές πεδίου.

Από τις αρχές της δεκαετίας του 1990, πολλά εργαστήρια έχουν αρχίσει να αναπτύσσουν τεχνολογία ενίσχυσης σταθερής θερμοκρασίας που δεν απαιτεί θερμική μετουσίωση.Τώρα έχουν αναπτύξει τεχνολογία ισοθερμικής ενίσχυσης με μεσολάβηση βρόχου, τεχνολογία ισοθερμικής ενίσχυσης αντικατάστασης κλώνου, τεχνολογία ισοθερμικής ενίσχυσης κυλιόμενου κύκλου και εξάρτηση αλληλουχίας νουκλεϊκών οξέων.Τεχνολογία ισοθερμικής ενίσχυσης και άλλες τεχνολογίες. 

Lισοθερμική ενίσχυση με τη μεσολάβηση oop

Η αρχή της ενίσχυσης βασίζεται στο γεγονός ότι το DNA βρίσκεται σε κατάσταση δυναμικής ισορροπίας στους 65°C περίπου.Όταν οποιοσδήποτε εκκινητής είναι ζεύγη βάσεων και επεκτείνεται στο συμπληρωματικό τμήμα του δίκλωνου DNA, ο άλλος κλώνος θα διαχωριστεί και θα γίνει μονόκλωνος.

Σε αυτή τη θερμοκρασία, το DNA χρησιμοποιεί 4 συγκεκριμένους εκκινητές για να βασίζεται σε μια πολυμεράση DNA μετατόπισης κλώνου για να κάνει τη σύνθεση του DNA μετατόπισης κλώνου να αυτοκυκλοφορεί συνεχώς.

Προσδιορίστε πρώτα τις 6 συγκεκριμένες περιοχές F3, F2, F1, B1, B2, B3 στο γονίδιο στόχο και, στη συνέχεια, σχεδιάστε 4 εκκινητές με βάση αυτές τις 6 συγκεκριμένες περιοχές (όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα):

Το εμπρόσθιο εσωτερικό αστάρι (FIP) αποτελείται από F1c και F2.

Το πίσω εσωτερικό αστάρι (BIP) αποτελείται από B1c και B2 και το TTTT χρησιμοποιείται ως διαχωριστικό στη μέση.

Οι εξωτερικοί εκκινητές F3 και B3 αποτελούνται αντίστοιχα από περιοχές F3 και B3 στο γονίδιο στόχο.

Στο σύστημα αντίδρασης LAMP, η συγκέντρωση του εσωτερικού εκκινητή είναι αρκετές φορές μεγαλύτερη από αυτή του εξωτερικού εκκινητή.Ο εσωτερικός εκκινητής αρχικά συνδυάζεται με τον κλώνο μήτρας για να συντεθεί ένας συμπληρωματικός κλώνος για να σχηματιστεί ένας διπλός κλώνος DNA.Στη συνέχεια, ο εξωτερικός εκκινητής συνδυάζεται με τον κλώνο μήτρας για να σχηματίσει έναν διπλό κλώνο DNA.Κάτω από τη δράση της BstDNA πολυμεράσης, ο συμπληρωματικός κλώνος που συντίθεται από τον εσωτερικό εκκινητή απελευθερώνεται.Μετά από μια σειρά αντιδράσεων, ο συμπληρωματικός κλώνος τελικά σχηματίζει έναν μόνο κλώνο DNA με δομή αλτήρα.

Ο ίδιος ο μονόκλωνος DNA δομής αλτήρων χρησιμοποιείται ως πρότυπο για να σχηματίσει συνεχώς ένα DNA δομής μεταβατικού στελέχους-βρόχου με ανοιχτό άκρο.Οι εσωτερικοί και εξωτερικοί εκκινητές καθοδηγούν το DNA της μεταβατικής δομής στελέχους-βρόχου να υφίσταται συνεχώς αντιδράσεις μετατόπισης και επέκτασης κλώνου και τελικά σχηματίζουν πολλαπλές δομές στελέχους-βρόγχου με διαφορετικά μήκη.Μίγμα DNA.

Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της ισοθερμικής ενίσχυσης με μεσολάβηση βρόχου

Πλεονεκτήματα του LAMP:

(1) Υψηλή απόδοση ενίσχυσης, η οποία μπορεί να ενισχύσει αποτελεσματικά 1-10 αντίγραφα του γονιδίου στόχου εντός 1 ώρας και η αποτελεσματικότητα ενίσχυσης είναι 10-100 φορές μεγαλύτερη από αυτή της συνηθισμένης PCR.

(2) Ο χρόνος αντίδρασης είναι σύντομος, η ειδικότητα είναι ισχυρή και δεν απαιτείται ειδικός εξοπλισμός.

Μειονεκτήματα του LAMP:

(1) Οι απαιτήσεις για εκκινητές είναι ιδιαίτερα υψηλές.

(2) Το ενισχυμένο προϊόν δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για κλωνοποίηση και προσδιορισμό αλληλουχίας, αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο για κρίση.

(3) Λόγω της ισχυρής ευαισθησίας του, είναι εύκολο να σχηματιστούν αερολύματα, προκαλώντας ψευδώς θετικά αποτελέσματα και επηρεάζοντας τα αποτελέσματα των δοκιμών.

Sενίσχυση μετατόπισης τάσης

Η ενίσχυση μετατόπισης κλώνου (SDA) είναι μια in vitro τεχνική ενίσχυσης ισοθερμικού DNA που βασίζεται σε ενζυματική αντίδραση που προτάθηκε για πρώτη φορά από τον Αμερικανό μελετητή Walker το 1992.

Το βασικό σύστημα του SDA περιλαμβάνει μια περιοριστική ενδονουκλεάση, μια πολυμεράση DNA με δραστηριότητα μετατόπισης κλώνου, δύο ζεύγη εκκινητών, dNTPs και ιόντα ασβεστίου και μαγνησίου και ρυθμιστικά συστήματα.

Η αρχή της ενίσχυσης μετατόπισης κλώνου βασίζεται στη χημικά τροποποιημένη αλληλουχία αναγνώρισης περιοριστικής ενδονουκλεάσης και στα δύο άκρα του DNA στόχου.Η ενδονουκλεάση ανοίγει το κενό στον κλώνο DNA στη θέση αναγνώρισής του και η πολυμεράση DNA επεκτείνει το χάσμα 3' Τέλος και αντικαθιστά τον επόμενο κλώνο DNA.

Οι αντικατασταθείσες μονές έλικες DNA μπορούν να συνδυαστούν με εκκινητές και να επεκταθούν σε διπλούς κλώνους με DNA πολυμεράση.Αυτή η διαδικασία επαναλαμβάνεται συνεχώς, έτσι ώστε η αλληλουχία στόχος να ενισχύεται αποτελεσματικά.

Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της τεχνολογίας ενίσχυσης μετατόπισης κλώνου

Πλεονεκτήματα του SDA:

Η απόδοση ενίσχυσης είναι υψηλή, ο χρόνος αντίδρασης είναι σύντομος, η ειδικότητα είναι ισχυρή και δεν απαιτείται ειδικός εξοπλισμός.

Μειονεκτήματα του SDA:

Τα προϊόντα δεν είναι ομοιόμορφα και ορισμένα μονόκλωνα και δίκλωνα προϊόντα παράγονται πάντα στον κύκλο SDA και η ουρά θα συμβεί αναπόφευκτα όταν ανιχνευθεί με ηλεκτροφόρηση.

RΕνίσχυση κύκλου olling

Η ενίσχυση κυλιόμενου κύκλου (RCA) προτείνεται με βάση τη μέθοδο αντιγραφής DNA από παθογόνους οργανισμούς με κυλιόμενο κύκλο.Αναφέρεται στη χρήση μονόκλωνου κυκλικού DNA ως μήτρας σε σταθερή θερμοκρασία και μιας ειδικής πολυμεράσης DNA (όπως Phi29) ) Υπό τη δράση της σύνθεσης DNA κυλιόμενου κύκλου για την επίτευξη της ενίσχυσης του γονιδίου στόχου.

Το RCA μπορεί να χωριστεί σε γραμμική ενίσχυση και εκθετική ενίσχυση.Η απόδοση του γραμμικού RCA μπορεί να φτάσει το 10⁵φορές και η απόδοση του εκθετικού RCA μπορεί να φτάσει το 10⁹φορές.

Απλή διάκριση, όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα, η γραμμική ενίσχυση a χρησιμοποιεί μόνο 1 εκκινητή, η εκθετική ενίσχυση b έχει 2 εκκινητές.

Το Linear RCA ονομάζεται επίσης single primer RCA.Ένας εκκινητής συνδέεται με κυκλικό DNA και επεκτείνεται με τη δράση της DNA πολυμεράσης.Το προϊόν είναι ένα γραμμικό μονόκλωνο με μεγάλο αριθμό επαναλαμβανόμενων ακολουθιών χιλιάδες φορές το μήκος ενός μόνο βρόχου.

Δεδομένου ότι το προϊόν του γραμμικού RCA συνδέεται πάντα με τον εκκινητή εκκίνησης, η εύκολη στερέωση του σήματος είναι ένα σημαντικό πλεονέκτημα.

Εκθετικό RCA, γνωστό και ως Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), στο εκθετικό RCA, ένας εκκινητής ενισχύει το προϊόν RCA, ο δεύτερος εκκινητής υβριδοποιείται με το προϊόν RCA και επεκτείνεται και η αντικατάσταση είναι ήδη συνδεδεμένη με το προϊόν RCA.

Τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα της ενίσχυσης κυλιόμενου νουκλεϊκού οξέος

Πλεονεκτήματα του RCA:

Υψηλή ευαισθησία, καλή ειδικότητα και εύκολη λειτουργία.

Μειονεκτήματα του RCA:

Προβλήματα παρασκηνίου κατά την ανίχνευση σήματος.Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης RCA, ο μη κυκλοφορημένος ανιχνευτής λουκέτου και το πρότυπο DNA ή RNA του μη δεσμευμένου ανιχνευτή μπορεί να δημιουργήσουν ορισμένα σήματα υποβάθρου. 

Nενίσχυση βασισμένη σε αλληλουχία ουκλεϊκοξέος

Η ενίσχυση με βάση την αλληλουχία νουκλεϊκών οξέων (NASBA) είναι μια νέα τεχνολογία που αναπτύχθηκε με βάση την PCR.Είναι μια συνεχής και ισοθερμική ενίσχυση νουκλεϊκού οξέος που καθοδηγείται από ένα ζεύγος εκκινητών με μια αλληλουχία προαγωγέα Τ7.Η τεχνολογία μπορεί να ενισχύσει το πρότυπο RNA κατά περίπου 109 φορές σε περίπου 2 ώρες, που είναι 1000 φορές υψηλότερο από τη συμβατική μέθοδο PCR και δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό.

Αυτή η τεχνολογία έχει χρησιμοποιηθεί για ταχεία διάγνωση ασθενειών αμέσως μόλις εμφανίστηκε και πολλές εταιρείες χρησιμοποιούν αυτήν τη μέθοδο σε κιτ ανίχνευσης RNA.

Αν και η ενίσχυση RNA μπορεί επίσης να χρησιμοποιήσει την τεχνολογία PCR αντίστροφης μεταγραφής, το NASBA έχει τα δικά του πλεονεκτήματα: μπορεί να πραγματοποιηθεί υπό σχετικά σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας και είναι πιο σταθερή και ακριβής από την παραδοσιακή τεχνολογία PCR.

Η αντίδραση είναι στους 41 βαθμούς Κελσίου και απαιτεί ανάστροφη μεταγραφάση AMV (ιός μυελοβλάστωσης πτηνών), RNase H, Τ7 RNA πολυμεράση και ένα ζεύγος εκκινητών για να ολοκληρωθεί.

Η διαδικασία περιλαμβάνει κυρίως:

Ο εμπρόσθιος εκκινητής περιέχει τη συμπληρωματική αλληλουχία του προαγωγέα Τ7.Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης, ο εμπρόσθιος εκκινητής συνδέεται με τον κλώνο RNA και καταλύεται από το ένζυμο AMV για να σχηματίσει έναν διπλό κλώνο DNA-RNA.

Η RNase H χωνεύει το RNA στον υβριδικό δίκλωνο και διατηρεί το μονόκλωνο DNA.

Κάτω από τη δράση του ανάστροφου εκκινητή και του ενζύμου AMV, σχηματίζεται ένας διπλός κλώνος DNA που περιέχει την αλληλουχία προαγωγέα Τ7.

Υπό τη δράση της Τ7 RNA πολυμεράσης, η διαδικασία μεταγραφής ολοκληρώνεται και παράγεται μεγάλη ποσότητα RNA στόχου.

Πλεονεκτήματα του NASBA:

(1) Ο εκκινητής του έχει αλληλουχία προαγωγέα Τ7, αλλά το ξένο δίκλωνο DNA δεν έχει αλληλουχία προαγωγέα Τ7 και δεν μπορεί να ενισχυθεί, επομένως αυτή η τεχνολογία έχει υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία.

(2) Το NASBA ενσωματώνει απευθείας τη διαδικασία αντίστροφης μεταγραφής στην αντίδραση ενίσχυσης, συντομεύοντας το χρόνο αντίδρασης.

Μειονεκτήματα του NASBA:

(1) Τα συστατικά της αντίδρασης είναι πιο περίπλοκα.

(2) Απαιτούνται τρία είδη ενζύμων για να αυξηθεί το κόστος της αντίδρασης.