Η PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) είναι μία από τις in vitro τεχνολογίες ενίσχυσης DNA, με ιστορικό άνω των 30 ετών.

Η τεχνολογία PCR πρωτοστάτησε από τον Kary Mullis από το Cetus των ΗΠΑ το 1983. Ο Mullis υπέβαλε αίτηση για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας PCR το 1985 και δημοσίευσε την πρώτη ακαδημαϊκή εργασία PCR για την Επιστήμη την ίδια χρονιά.Ο Mullis τιμήθηκε με το Νόμπελ Χημείας το 1993 για το έργο του.

Βασικές Αρχές PCR

Η PCR μπορεί να ενισχύσει τα θραύσματα του DNA στόχου περισσότερο από ένα εκατομμύριο φορές.Η αρχή είναι υπό την κατάλυση της DNA πολυμεράσης, χρησιμοποιώντας το DNA του μητρικού κλώνου ως πρότυπο και ειδικό εκκινητή ως σημείο εκκίνησης για επέκταση.Αναπαράγεται in vitro μέσω βημάτων όπως η μετουσίωση, η ανόπτηση και η επέκταση.Η διαδικασία του DNA θυγατρικού κλώνου συμπληρωματικού προς το πρότυπο DNA του μητρικού κλώνου.

Η τυπική διαδικασία PCR χωρίζεται σε τρία στάδια:

1.Μετουσίωση: Χρησιμοποιήστε υψηλή θερμοκρασία για να διαχωρίσετε διπλούς κλώνους DNA.Ο δεσμός υδρογόνου μεταξύ των διπλών κλώνων του DNA σπάει σε υψηλή θερμοκρασία (93-98℃).

2. Ανόπτηση: Αφού διαχωριστεί το δίκλωνο DNA, χαμηλώστε τη θερμοκρασία έτσι ώστε ο εκκινητής να συνδεθεί με το μονόκλωνο DNA.

3.Επέκταση: Η DNA πολυμεράση αρχίζει να συνθέτει συμπληρωματικές κλώνους κατά μήκος των κλώνων DNA από τους εκκινητές που συνδέονται όταν η θερμοκρασία πέσει.Όταν ολοκληρωθεί η επέκταση, ολοκληρώνεται ένας κύκλος και ο αριθμός των θραυσμάτων DNA διπλασιάζεται

Αντίστροφα αυτά τα τρία βήματα 25-35 φορές, ο αριθμός των θραυσμάτων DNA θα αυξηθεί εκθετικά.

Η ευρηματικότητα της PCR είναι ότι μπορούν να σχεδιαστούν διαφορετικοί εκκινητές για διαφορετικά γονίδια στόχους, έτσι ώστε τα θραύσματα γονιδίου στόχου να μπορούν να ενισχυθούν σε σύντομο χρονικό διάστημα.

Μέχρι στιγμής, η PCR μπορεί να χωριστεί σε τρεις κατηγορίες, δηλαδή σε συνηθισμένη PCR, φθορίζουσα ποσοτική PCR και ψηφιακή PCR.

Η πρώτη γενιά συνηθισμένης PCR

Χρησιμοποιήστε ένα συνηθισμένο όργανο ενίσχυσης PCR για να ενισχύσετε το γονίδιο στόχο και, στη συνέχεια, χρησιμοποιήστε ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης για να ανιχνεύσετε το προϊόν, μόνο ποιοτική ανάλυση μπορεί να γίνει.

Τα κύρια μειονεκτήματα της πρώτης γενιάς PCR:

1. Επιρρεπής σε μη ειδική ενίσχυση και ψευδώς θετικά αποτελέσματα.

2.Η ανίχνευση διαρκεί πολύ και η λειτουργία είναι κοπιαστική.

3. Μόνο ποιοτική δοκιμή μπορεί να γίνει

Δεύτερης γενιάς σε πραγματικό χρόνο PCR

Η PCR πραγματικού χρόνου, γνωστή και ως qPCR, χρησιμοποιεί ανιχνευτές φθορισμού που μπορούν να υποδείξουν την πρόοδο του συστήματος αντίδρασης και παρακολουθεί τη συσσώρευση ενισχυμένων προϊόντων μέσω της συσσώρευσης σημάτων φθορισμού και κρίνει τα αποτελέσματα μέσω της καμπύλης φθορισμού.Μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με τη βοήθεια της τιμής Cq και της τυπικής καμπύλης.

Επειδή η τεχνολογία qPCR πραγματοποιείται σε κλειστό σύστημα, η πιθανότητα μόλυνσης μειώνεται και το σήμα φθορισμού μπορεί να παρακολουθηθεί για ποσοτική ανίχνευση, επομένως είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη στην κλινική πράξη και έχει γίνει η κυρίαρχη τεχνολογία στην PCR.

Οι φθορίζουσες ουσίες που χρησιμοποιούνται στη φθορίζουσα ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο μπορούν να χωριστούν σε: Φθορίζον ανιχνευτή TaqMan, μοριακούς φάρους και φθορίζουσα βαφή.

1)Φθορίζων ανιχνευτής TaqMan:

Κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης PCR, προστίθεται ένας ειδικός ανιχνευτής φθορισμού ενώ προστίθεται ένα ζεύγος εκκινητή.Ο ανιχνευτής είναι ένα ολιγονουκλεοτίδιο και αμφότερα τα άκρα είναι σημασμένα με μια φθορίζουσα ομάδα αναφοράς και μια φθορίζουσα ομάδα σβέσης.

Όταν ο ανιχνευτής είναι άθικτος, το φθορίζον σήμα που εκπέμπεται από την ομάδα αναφοράς απορροφάται από την ομάδα σβέσης.κατά την ενίσχυση PCR, η δραστηριότητα 5'-3' εξωνουκλεάσης του ενζύμου Taq διασπά και αποικοδομεί τον ανιχνευτή, καθιστώντας τη φθορίζουσα ομάδα αναφοράς και σβήνει. Το σήμα φθορισμού συγχρονίζεται πλήρως με το σχηματισμό του προϊόντος PCR.

2) Φθορίζουσα βαφή SYBR:

Στο σύστημα αντίδρασης PCR, προστίθεται περίσσεια φθορίζουσας χρωστικής SYBR.Αφού η φθορίζουσα χρωστική SYBR ενσωματωθεί μη ειδικά στη διπλή έλικα DNA, εκπέμπει ένα φθορίζον σήμα.Το μόριο βαφής SYBR που δεν είναι ενσωματωμένο στην αλυσίδα δεν θα εκπέμπει φθορίζον σήμα, διασφαλίζοντας έτσι το φθορίζον σήμα Η αύξηση των προϊόντων PCR συγχρονίζεται πλήρως με την αύξηση των προϊόντων PCR.Το SYBR συνδέεται μόνο με δίκλωνο DNA, επομένως η καμπύλη τήξης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προσδιοριστεί εάν η αντίδραση PCR είναι ειδική.

3) Μοριακός φάρος:

Είναι ένας ολιγονουκλεοτιδικός ανιχνευτής διπλής επισήμανσης με στελέχη βρόχου που σχηματίζει μια δομή φουρκέτας περίπου 8 βάσεων στα 5 και 3 άκρα.Οι αλληλουχίες νουκλεϊκού οξέος και στα δύο άκρα είναι συμπληρωματικά ζευγαρωμένες, με αποτέλεσμα η ομάδα φθορισμού και η ομάδα σβέσης να είναι σφιχτές.Κλείστε, δεν θα παραχθεί φθορισμός.

Αφού δημιουργηθεί το προϊόν PCR, κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ανόπτησης, το μεσαίο τμήμα του μοριακού φάρου ζευγαρώνεται με μια συγκεκριμένη αλληλουχία DNA και το φθορίζον γονίδιο διαχωρίζεται από το γονίδιο σβέσης για να παράγει φθορισμό.

Τα κύρια μειονεκτήματα της PCR δεύτερης γενιάς:

Η ευαισθησία εξακολουθεί να λείπει και η ανίχνευση δειγμάτων χαμηλού αντιγράφου είναι ανακριβής.

Υπάρχει η επίδραση της τιμής φόντου και το αποτέλεσμα είναι επιρρεπές σε παρεμβολές.

Όταν υπάρχουν αναστολείς PCR στο σύστημα αντίδρασης, τα αποτελέσματα ανίχνευσης είναι επιρρεπή σε παρεμβολές.

Ψηφιακή PCR τρίτης γενιάς

Η ψηφιακή PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) υπολογίζει τον αριθμό αντιγράφων της αλληλουχίας στόχου μέσω της ανίχνευσης τελικού σημείου και μπορεί να εκτελέσει ακριβή απόλυτη ποσοτική ανίχνευση χωρίς τη χρήση εσωτερικών ελέγχων και τυπικών καμπυλών.

Η ψηφιακή PCR χρησιμοποιεί ανίχνευση τελικού σημείου και δεν εξαρτάται από την τιμή Ct (ουδός κύκλου), επομένως η ψηφιακή αντίδραση PCR επηρεάζεται λιγότερο από την αποτελεσματικότητα ενίσχυσης και η ανοχή στους αναστολείς αντίδρασης PCR βελτιώνεται, με υψηλή ακρίβεια και αναπαραγωγιμότητα.

Λόγω των χαρακτηριστικών της υψηλής ευαισθησίας και της υψηλής ακρίβειας, δεν παρεμβάλλεται εύκολα από αναστολείς αντίδρασης PCR και μπορεί να επιτύχει πραγματική απόλυτη ποσοτικοποίηση χωρίς τυποποιημένα προϊόντα, που έχει γίνει hotspot έρευνας και εφαρμογής.

Ανάλογα με τις διαφορετικές μορφές της μονάδας αντίδρασης, μπορεί να χωριστεί σε τρεις κύριους τύπους: μικρορευστοποιητικά, τσιπ και συστήματα σταγονιδίων.

1) Microfluidic digital PCR, mdPCR:

Με βάση την τεχνολογία μικρορευστοποίησης, το πρότυπο DNA διαχωρίζεται.Η τεχνολογία μικρορευστοποίησης μπορεί να πραγματοποιήσει τη νανο-αναβάθμιση του δείγματος ή τη δημιουργία μικρότερων σταγονιδίων, αλλά τα σταγονίδια χρειάζονται μια ειδική μέθοδο προσρόφησης και στη συνέχεια να συνδυαστούν με το σύστημα αντίδρασης PCR.Το mdPCR έχει σταδιακά υιοθετηθεί με άλλες μεθόδους αντικατάστασης.

2) Ψηφιακή PCR με βάση σταγονίδια, ddPCR:

Χρησιμοποιήστε την τεχνολογία δημιουργίας σταγονιδίων νερό σε λάδι για να επεξεργαστείτε το δείγμα σε σταγονίδια και διαιρέστε το σύστημα αντίδρασης που περιέχει μόρια νουκλεϊκού οξέος σε χιλιάδες σταγονίδια νανοκλίμακας, καθένα από τα οποία δεν περιέχει το προς ανίχνευση μόριο νουκλεϊκού οξέος ή περιέχει ένα έως πολλά μόρια στόχους νουκλεϊκού οξέος προς δοκιμή.

3) Ψηφιακή PCR με βάση τσιπ, cdPCR:

Χρησιμοποιήστε την τεχνολογία ενσωματωμένης διαδρομής υγρού για να χαράξετε πολλούς μικροσωλήνες και μικροκοιλότητες σε γκοφρέτες πυριτίου ή γυαλί χαλαζία και να ελέγξετε τη ροή του διαλύματος μέσω διαφορετικών βαλβίδων ελέγχου και να διαιρέσετε το υγρό δείγματος σε νανόμετρα ίδιου μεγέθους στα φρεάτια αντίδρασης για ψηφιακή αντίδραση PCR για να επιτευχθεί απόλυτη ποσοτικοποίηση.

Τα κύρια μειονεκτήματα της τρίτης γενιάς PCR:

Ο εξοπλισμός και τα αντιδραστήρια είναι ακριβά.

Οι απαιτήσεις ποιότητας του προτύπου είναι υψηλές.Εάν η ποσότητα του προτύπου υπερβαίνει την ποσότητα του μικροσυστήματος, θα είναι αδύνατο να προσδιοριστεί ποσοτικά και εάν είναι πολύ μικρή, η ακρίβεια ποσοτικοποίησης θα μειωθεί.

Μπορούν επίσης να δημιουργηθούν ψευδώς θετικά όταν υπάρχει μη ειδική ενίσχυση.