Το COVID-19 είναι μια μολυσματική ασθένεια που προκαλείται από το Σοβαρό Οξύ Αναπνευστικό Σύνδρομο Κορονοϊός Τύπου 2. Όταν ένα άτομο μολύνεται, τα πιο κοινά συμπτώματα περιλαμβάνουν πυρετό, βήχα και δύσπνοια.

Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο μπορούν να συλλεχθούν με ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα ή στοματοφαρυγγικά επιχρίσματα.

Τι είναι η PCR;

Η τυπική μέθοδος ανίχνευσης του κορωνοϊού είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, PCR.Αυτή είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται ευρέως στη μοριακή βιολογία.Μπορεί γρήγορα να αντιγράψει εκατομμύρια έως δισεκατομμύρια συγκεκριμένα θραύσματα DNA.

Ο νέος κοροναϊός περιέχει ένα πολύ μακρύ μονόκλωνο γονιδίωμα RNA.Προκειμένου να ανιχνευθούν αυτοί οι ιοί με PCR, τα μόρια RNA πρέπει να μετατραπούν στις συμπληρωματικές αλληλουχίες DNA τους με ανάστροφη μεταγραφάση και στη συνέχεια το νεοσυντιθέμενο DNA μπορεί να ενισχυθεί με τυπικές διαδικασίες PCR, που είναι κοινώς γνωστές ως RT-PCR.

Διαδικασία RT-PCR

Εκχύλιση RNA

Για την εκτέλεση αυτής της μεθόδου, το ιικό RNA θα πρέπει βασικά να εξαχθεί.Μια ποικιλία κιτ καθαρισμού RNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για βολικό, γρήγορο και αποτελεσματικό διαχωρισμό.

Για να εξαγάγετε ιικό RNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ του εμπορίου, προσθέστε πρώτα το δείγμα σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης και μετά αναμείξτε το με το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης.Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα είναι σε μεγάλο βαθμό μετουσιωμένο και συνήθως αποτελείται από φαινόλη και ισοθειοκυανική γουανιδίνη.Επιπλέον, αναστολείς RNase συνήθως υπάρχουν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για να διασφαλιστεί η απομόνωση του ανέπαφου ιικού RNA.

Μετά την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, αναδεύστε τον σωλήνα ανάμιξης με παλμό και επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου.Ο ιός στη συνέχεια λύεται κάτω από συνθήκες υψηλής μετουσίωσης που παρέχονται από το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης.

Μετά τη λύση του δείγματος, χρησιμοποιείται ένας σωλήνας φυγοκέντρησης για τη διαδικασία καθαρισμού.Το δείγμα φορτώνεται στο σωλήνα φυγοκέντρησης και στη συνέχεια φυγοκεντρείται.

Αυτή η διαδικασία είναι μια μέθοδος εκχύλισης στερεάς φάσης στην οποία η στατική φάση αποτελείται από μια μήτρα πυριτικής πηκτής.

Κάτω από βέλτιστες συνθήκες άλατος και pH, τα μόρια RNA συνδέονται με τη μεμβράνη του πυριτίου.

Ταυτόχρονα, αφαιρούνται οι πρωτεΐνες και άλλοι ρύποι.

Μετά τη φυγοκέντρηση, τοποθετήστε το σωλήνα φυγοκέντρησης σε έναν καθαρό σωλήνα συλλογής, απορρίψτε το διήθημα και, στη συνέχεια, προσθέστε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης.

Τοποθετήστε ξανά το σωληνάριο στη φυγόκεντρο για να πιέσετε το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης μέσα από τη μεμβράνη.Αυτό θα αφαιρέσει όλες τις υπόλοιπες ακαθαρσίες από τη μεμβράνη, αφήνοντας μόνο το RNA συνδεδεμένο στο silica gel.

Αφού πλυθεί το δείγμα, τοποθετήστε το σωληνάριο σε καθαρό σωλήνα μικροφυγοκέντρησης και προσθέστε το ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης.

Στη συνέχεια φυγοκεντρείται για να εξαναγκάσει το ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης μέσω της μεμβράνης.Το ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης αφαιρεί το ιικό RNA από τη στήλη spin και λαμβάνει καθαρισμένο RNA απαλλαγμένο από πρωτεΐνες, αναστολείς και άλλους μολυντές.

ΒΗΜΑ 2

Μικτό συμπύκνωμα

Μετά την εκχύλιση του ιικού RNA, το επόμενο βήμα είναι η προετοιμασία του μίγματος αντίδρασης για ενίσχυση PCR.Σε αυτό το βήμα, χρησιμοποιείται συμπύκνωμα.Αυτό το συμπυκνωμένο διάλυμα είναι ένα προαναμεμειγμένο συμπυκνωμένο διάλυμα που αποτελείται από ένα προμίγμα, ανάστροφη μεταγραφάση, νουκλεοτίδια, εμπρόσθιο εκκινητή, ανάστροφο εκκινητή, ανιχνευτή TaqMan και πολυμεράση DNA.

Τέλος, για να ολοκληρωθεί αυτό το μείγμα αντίδρασης, προστίθεται το εκμαγείο RNA.Οι σωλήνες αναμειγνύονται με παλμικό στροβιλισμό και στη συνέχεια το μίγμα της αντίδρασης φορτώνεται στην πλάκα PCR.Η πλάκα PCR περιέχει συνήθως 96 φρεάτια και μπορεί να αναλύσει πολλά δείγματα ταυτόχρονα.

ΒΗΜΑ 3

Ενίσχυση PCR

Στη συνέχεια, τοποθετήστε την πλάκα στη μηχανή PCR, η οποία είναι ουσιαστικά ένας θερμικός κυκλοποιητής.

Η RT-PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του νέου κοροναϊού του 2019 ενισχύοντας την αλληλουχία στόχο στο γονίδιο RdrRP, το γονίδιο E και το γονίδιο N.Η επιλογή του γονιδίου στόχου εξαρτάται από τον εκκινητή και την αλληλουχία ανιχνευτή.

Το πρώτο βήμα της RT-PCR είναι η αντίστροφη μεταγραφή.Συντίθεται ο πρώτος κλώνος του συμπληρωματικού DNA, ο οποίος ξεκινά από τον αντίστροφο εκκινητή PCR, ο οποίος συνδέεται με το συμπληρωματικό τμήμα του γονιδιώματος του ιικού RNA.Στη συνέχεια, η αντίστροφη μεταγραφάση προσθέτει νουκλεοτίδια DNA στο 3' άκρο του εκκινητή για να συνθέσει DNA συμπληρωματικό προς το ιικό RNA.Η θερμοκρασία και η διάρκεια αυτού του σταδίου εξαρτώνται από τους εκκινητές, το RNA στόχο και την αντίστροφη μεταγραφάση που χρησιμοποιούνται.

Στη συνέχεια, εφαρμόζεται ένα αρχικό στάδιο μετουσίωσης, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα τη μετουσίωση του υβριδίου RNA-DNA.Αυτό το βήμα είναι απαραίτητο για την ενεργοποίηση της DNA πολυμεράσης.Ταυτόχρονα, η αντίστροφη μεταγραφάση απενεργοποιείται.

Η PCR αποτελείται από μια σειρά θερμικών κύκλων.Κάθε κύκλος αποτελείται από στάδια μετουσίωσης, ανόπτησης και επέκτασης.

Το στάδιο μετουσίωσης περιλαμβάνει θέρμανση του θαλάμου αντίδρασης στους 95 βαθμούς Κελσίου και χρήση του για μετουσίωση του εκμαγείου δίκλωνου DNA.

Στο επόμενο βήμα, η θερμοκρασία της αντίδρασης μειώνεται στους 58 βαθμούς Κελσίου, επιτρέποντας στον εμπρόσθιο εκκινητή να ανόπτεται στο συμπληρωματικό τμήμα του μονόκλωνου προτύπου DNA του.Η θερμοκρασία ανόπτησης εξαρτάται άμεσα από το μήκος και τη σύνθεση του ασταριού.

Στο στάδιο επέκτασης, η DNA πολυμεράση συνθέτει έναν νέο κλώνο DNA που είναι συμπληρωματικός προς τον κλώνο μήτρας DNA.Με την προσθήκη ελεύθερων πυρήνων συμπληρωματικών στο εκμαγείο στην κατεύθυνση 5' έως 3' από το μείγμα αντίδρασης.Η θερμοκρασία αυτού του σταδίου εξαρτάται από τη χρησιμοποιούμενη πολυμεράση DNA.

Μετά τον πρώτο κύκλο, λαμβάνεται ένας στόχος δίκλωνου DNA.

Στη συνέχεια, μπείτε στον δεύτερο κύκλο.Το δίκλωνο DNA μετουσιώνεται για να παραχθούν δύο μονόκλωνα μόρια DNA.

Στο επόμενο βήμα, η θερμοκρασία της αντίδρασης μειώνεται, οι εκκινητές συγκολλούνται σε κάθε μονόκλωνο εκμαγείο DNA και ο ανιχνευτής Taq-man συγκολλάται στο συμπληρωματικό τμήμα του DNA στόχου.

Ο ανιχνευτής TaqMan αποτελείται από ένα φθοροφόρο ομοιοπολικά συνδεδεμένο με το 5' άκρο του ολιγονουκλεοτιδικού ανιχνευτή.Όταν διεγείρεται από την πηγή φωτός του κυκλοποιητή, το φθοροφόρο εκπέμπει φθορισμό.Επιπλέον, ο ανιχνευτής αποτελείται από έναν αποσβεστήρα στο 3'άκρο.Η εγγύτητα του γονιδίου αναφοράς στο σβηστήρα εμποδίζει την ανίχνευση του φθορισμού.

Στο στάδιο επέκτασης, η DNA πολυμεράση συνθέτει έναν νέο κλώνο.Όταν η πολυμεράση φτάσει στον ανιχνευτή TaqMan, η ενδογενής 5' νουκλεάση της δράσης διασπά τον ανιχνευτή, διαχωρίζοντας τη χρωστική από τον σβηστήρα.

Με κάθε κύκλο PCR, απελευθερώνονται περισσότερα μόρια χρωστικής, με αποτέλεσμα αύξηση της έντασης φθορισμού ανάλογη με τον αριθμό των αμπλικονίων που συντίθενται.

Αυτή η μέθοδος επιτρέπει την εκτίμηση του αριθμού μιας δεδομένης ακολουθίας που υπάρχει στο δείγμα.Ο αριθμός των δίκλωνων θραυσμάτων DNA διπλασιάζεται σε κάθε κύκλο.Επομένως, η PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση πολύ μικρών δειγμάτων.

Για μέτρηση σήματος φθορισμού, λάμπα αλογόνου βολφραμίου, φίλτρο διέγερσης, ανακλαστήρας, φακός, φίλτρο εκπομπής και κάμερα CCD με συζευγμένη συσκευή χρήσης.

ΒΗΜΑ 4 Ανίχνευση

Για μέτρηση σήματος φθορισμού, λάμπα αλογόνου βολφραμίου, φίλτρο διέγερσης, ανακλαστήρας, φακός, φίλτρο εκπομπής και κάμερα CCD με συζευγμένη συσκευή χρήσης.

Το φιλτραρισμένο φως από τη λάμπα ανακλάται από τον ανακλαστήρα, διέρχεται από τον φακό του συμπυκνωτή και εστιάζεται στο κέντρο κάθε οπής.Στη συνέχεια, ο φθορισμός που εκπέμπεται από την τρύπα ανακλάται από τον καθρέφτη, περνά μέσα από το φίλτρο εκπομπής και ανιχνεύεται από την κάμερα CCD.Σε κάθε κύκλο PCR, το αυτοδιεγερμένο φως φθοροφόρου μπορεί να ανιχνευθεί από το CCD.

Μετατρέπει το φως που συλλαμβάνεται σε ψηφιακά δεδομένα.Αυτή η μέθοδος ονομάζεται PCR πραγματικού χρόνου και επιτρέπει την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο της προόδου της αντίδρασης PCR.