Όλοι μιλούν για την αρχή του πειράματος qRT-PCR, τον σχεδιασμό εκκινητών, την ερμηνεία των αποτελεσμάτων κ.λπ., αλλά νομίζω ότι πρέπει να μοιραστώ μαζί σας την πειραματική λειτουργία του qRT-PCR.Είναι μικρό, αλλά έχει να κάνει με τα αποτελέσματα.
Πριν κάνουμε qRT-PCR, πρέπει να έχουμε ξεκάθαρη κατανόηση του δικού μας RNA και των μεθόδων λειτουργίας μας.Άλλωστε, οι προσπάθειές μας στοχεύουν στην επίτευξη αποτελεσμάτων, παρά στην απλή εξάσκηση.Επομένως, πριν κάνουμε qRT-PCR, πρέπει να προσδιορίσουμε τα ακόλουθα ζητήματα (μερικά από τα οποία ισχύουν μόνο για το SYBR).
1 Είστε σίγουροι ότι το RNA σας δεν υποβαθμίζεται;
Το NanoDrop 2000 μπορεί να ανιχνεύσει μόνο τη συγκέντρωση και την καθαρότητα του RNA, αλλά δεν μπορεί να ανιχνεύσει την ακεραιότητα του RNA.
Η τιμή RNA (RNA Intesity Number) μπορεί να αντικατοπτρίζει την ακεραιότητα του RNA, η οποία ανιχνεύεται από το σύστημα Agilent 2100 Bioanalyzer.
Εικ. Σχηματικό διάγραμμα τιμών RIN για διαφορετικά δείγματα RNA (ευκαρυώτες)
Ωστόσο, τα εργαστήρια γενικά δεν διαθέτουν Agilent 2100 Bioanalyzer.Σε αυτή την περίπτωση, μπορούμε να ανιχνεύσουμε μέσω της γέλης φορμαλδεΰδης, αλλά η απαίτηση για τη συνολική ποσότητα RNA είναι υψηλή, επομένως η ταχύτερη μέθοδος είναι η χρήση συνηθισμένης ηλεκτροφόρησης γέλης.Απαιτείται να βρίσκεται σε περιβάλλον χωρίς νουκλεάσες, επομένως είναι απαραίτητο να ξεπλύνετε τη δεξαμενή ηλεκτροφόρησης, τη φιάλη διαλύματος, το βραχίονα γέλης και τη χτένα με νερό DEPC.Η αγαρόζη είναι επίσης χωρίς νουκλεάση (εφόσον είναι πρόσφατα ανοιγμένη) και το ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης θα πρέπει να είναι πρόσφατα ανοιγμένο όσο το δυνατόν περισσότερο, με γέλη 1,2%.
Σημειώστε ότι η γέλη πρέπει να διαλυθεί πλήρως, διαφορετικά θα προκαλέσει ανομοιογενείς ταινίες, όπως φαίνεται στο δείγμα 9 στο σχήμα.Εάν η τάση είναι πολύ υψηλή ή λειτουργεί για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα, θα δημιουργήσει θερμότητα και θα προκαλέσει υποβάθμιση του RNA, επομένως η τάση και ο χρόνος θα πρέπει να ελέγχονται λογικά.Επιπλέον, η λειτουργία γέλης μπορεί επίσης να προσδιορίσει περαιτέρω εάν υπάρχει υπόλειμμα DNA στο δείγμα και να παρατηρήσει εάν υπάρχει μεγάλος αριθμός συγκρατούμενων ζωνών στο φρεάτιο διανομής.
Εικόνα.Ανίχνευση RNA με ηλεκτροφόρηση γέλης
2 Είστε σίγουροι για τη συγκέντρωση του cDNA σας;
Η εμπειρία των μεγάλων αδερφών στο εργαστήριο είναι ότι το cDNA του συστήματος των 20 ul που λαμβάνεται με κάθε αναστροφή αραιώνεται απευθείας 20Χ, ενώ οι μεταδιδακτορικές αδερφές αραιώνονται 10Χ.Συνήθως εξαρτώμαι από την κατάσταση.Επειδή η ποιότητα του RNA που αναφέρεται από κάθε άτομο είναι διαφορετική, το επίπεδο αναστροφής είναι επίσης διαφορετικό και η τεχνολογία αναστροφής μπορεί να μην είναι σταθερή.
Έτσι, κάθε φορά που παίρνω το αντίστροφο cDNA, θα το αραιώνω πρώτα περίπου 3 φορές και μετά θα χρησιμοποιώ το γονίδιο housekeeping για να κάνω RT-PCR, ο αριθμός των κύκλων είναι γενικά 25 κύκλοι, για να προσδιορίσω τη συγκεκριμένη συγκέντρωση και μετά να προσδιορίσω τον τελικό παράγοντα αραίωσης.
3 Είστε σίγουροι ότι τα αστάρια σας είναι εύχρηστα;
Μπορεί να περάσει την καμπύλη τήξης του qRT-PCR, αλλά αυτό εξακολουθεί να κοστίζει χρήματα.Για εργαστήρια χωρίς πολλά χρήματα, όταν παίρνουν πολλούς εκκινητές, μπορούν να χρησιμοποιήσουν συνηθισμένη RT-PCR για να δουν αν είναι μία μόνο ζώνη και να αναγνωρίσουν την ειδικότητα των εκκινητών.Εάν το εργαστήριο δεν έχει χρήματα, η ειδικότητα όλων των εκκινητών μπορεί να προσδιοριστεί μία φορά μέσω της καμπύλης τήξης.
4 Είστε σίγουροι ότι οι πειραματικές σας συνθήκες είναι κατάλληλες;
Το SYBR θα πρέπει να προστατεύεται από έντονο φως, γι' αυτό προσπαθήστε να σβήσετε το υπερυψωμένο φως όταν προσθέτετε αντιδραστήριο SYBR και χρειάζεται μόνο να χρησιμοποιήσετε αμυδρό φως για να το ολοκληρώσετε.
Αποθηκεύστε το SYBR στους 4°C.Κατά τη χρήση, αναποδογυρίστε απαλά προς τα πάνω και προς τα κάτω για να αναμειχθεί καλά για να αποφευχθεί ο αφρισμός και μην ανακινήσετε έντονα.
Σε ορισμένες μικρότερες αδερφές αρέσει να σχεδιάζουν σημάδια στον πίνακα PCR από φόβο μήπως ανακατέψουν τα δείγματα, κάτι που είναι λάθος.Επειδή οι δείκτες σας είναι πολύ πιθανό να επηρεάσουν τη συλλογή των σημάτων φθορισμού, γενικά προτείνω στους νεαρούς να χρησιμοποιούν πειραματικά σημειωματάρια για να βοηθήσουν στη μνήμη, όπως φαίνεται παρακάτω.
Εικόνα.Διάγραμμα φόρτωσης δείγματος qRT-PCR
5 Είστε σίγουροι ότι το κάνετε σωστά;
Φροντίστε να φοράτε γάντια, να φοράτε γάντια, να φοράτε γάντια και να πείτε σημαντικά πράγματα τρεις φορές.
Για να μειώσω την έκθεση του SYBR στο φως, προσωπικά μου αρέσει να προσθέσω πρώτα ένα πρότυπο, όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα.Σύμφωνα με την εμπειρία, η προσθήκη μικρής ποσότητας προτύπου είναι πιθανό να προκαλέσει σφάλματα δειγματοληψίας.Επομένως, για να ελαχιστοποιήσω το σφάλμα που προκαλείται από την προσθήκη μιας μικρής ποσότητας προτύπου, συνήθως διπλασιάζω ξανά το δείγμα και διπλασιάζω την ποσότητα κατά την προσθήκη του δείγματος για να μειώσω την ποσότητα του H2O2 που προστίθεται.
Εικόνα.Σχηματικό διάγραμμα φόρτωσης qRT-PCR
Στη συνέχεια, διαμορφώστε το σύστημα qRT-PCR ως εξής.
Εικόνα.Διάγραμμα προετοιμασίας συστήματος qRT-PCR
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η διαδικασία διαμόρφωσης πρέπει να γίνει σε πάγο.
Αφού προσθέσετε το δείγμα, επικολλήστε τη διαφανή μεμβράνη σφράγισης.Προσπαθήστε να μην αγγίζετε την επιφάνεια της διαφανούς μεμβράνης στεγανοποίησης με τα χέρια σας, απλώς λειτουργήστε από το χώρο και στις δύο πλευρές της μεμβράνης.Επειδή τα δακτυλικά αποτυπώματα μπορεί επίσης να επηρεάσουν τη συλλογή των σημάτων φθορισμού.Στη συνέχεια, χρησιμοποιήστε μια φυγόκεντρο για γρήγορη φυγοκέντρηση για 10 δευτερόλεπτα σε χαμηλή ταχύτητα για να αποτρέψετε το να κρέμεται το δείγμα στον τοίχο.
Σχετικά προϊόντα:
Ώρα δημοσίευσης: Απρ-28-2023
