Ως νέο στο εργαστήριο, δεν είναι καλή δουλειά να ελέγχετε θετικά φυτά από μια δέσμη φυτών με χαμηλό ποσοστό μετατροπής.Αρχικά, το DNA πρέπει να εξαχθεί από μεγάλο αριθμό δειγμάτων ένα προς ένα και στη συνέχεια τα ξένα γονίδια θα ανιχνευθούν με PCR.Ωστόσο, τα αποτελέσματα είναι συχνά κενά και ζώνες με λίγα στοιχεία περιστασιακά, αλλά είναι αδύνατο να προσδιοριστεί εάν υπάρχουν χαμένες ανιχνεύσεις ή ψευδείς ανιχνεύσεις..Είναι πολύ ανήμπορο να αντιμετωπίζεις μια τέτοια πειραματική διαδικασία και αποτελέσματα;Μην ανησυχείτε, ο αδελφός σας διδάσκει πώς να ελέγχετε τα διαγονιδιακά θετικά φυτά εύκολα και με ακρίβεια.

Βήμα 1

Αστάρια ανίχνευσης σχεδίου

Προσδιορίστε το ενδογενές γονίδιο και το εξωγενές γονίδιο που θα ανιχνευθεί σύμφωνα με το δείγμα που θα δοκιμαστεί και επιλέξτε μια αντιπροσωπευτική αλληλουχία 100-500 bp στο γονίδιο για το σχεδιασμό εκκινητών.Οι καλοί εκκινητές μπορούν να εξασφαλίσουν την ακρίβεια των αποτελεσμάτων ανίχνευσης και να μειώσουν το χρόνο ανίχνευσης (δείτε το παράρτημα για τα ευρέως χρησιμοποιούμενα εκκινητές ανίχνευσης).

Σημείωση: Οι νεοσχεδιασμένοι εκκινητές πρέπει να βελτιστοποιούν τις συνθήκες αντίδρασης και να επαληθεύουν την ακρίβεια, την ακρίβεια και το όριο ανίχνευσης της ανίχνευσης πριν από την ανίχνευση μεγάλης κλίμακας.

Βήμα 2

Σχεδιασμός πειραματικού πρωτοκόλλου

Θετικός έλεγχος: Χρησιμοποιήστε το καθαρισμένο DNA που περιέχει το θραύσμα στόχο ως πρότυπο για να προσδιορίσετε εάν το σύστημα και οι συνθήκες αντίδρασης PCR είναι φυσιολογικές.

Αρνητικός/τυφλός έλεγχος: Χρησιμοποιήστε το πρότυπο DNA ή το ddH2O που δεν περιέχει το θραύσμα στόχο ως πρότυπο για να ανιχνεύσετε εάν υπάρχει πηγή μόλυνσης στο σύστημα PCR.

Εσωτερικός έλεγχος αναφοράς: χρησιμοποιήστε τον συνδυασμό εκκινητή/ανιχνευτή του ενδογενούς γονιδίου του προς δοκιμή δείγματος για να αξιολογήσετε εάν το πρότυπο μπορεί να ανιχνευθεί με PCR.

Ειδοποίηση:

Θα πρέπει να ορίζονται θετικοί, αρνητικοί/τυφλοί έλεγχοι και έλεγχοι εσωτερικού ελέγχου για κάθε δοκιμή για την αξιολόγηση της εγκυρότητας των πειραματικών αποτελεσμάτων.

Προετοιμασία πειράματος

Πριν από τη χρήση, παρατηρήστε εάν το διάλυμα έχει αναμειχθεί ομοιόμορφα.Εάν εντοπιστεί καθίζηση, πρέπει να διαλυθεί και να αναμειχθεί σύμφωνα με τις οδηγίες πριν από τη χρήση.Το μείγμα 2×PCR πρέπει να αναμιχθεί με πιπέτα και να αναμιχθεί επανειλημμένα με μικροσιφώνιο πριν από τη χρήση για να αποφευχθεί η άνιση κατανομή ιόντων.

Ειδοποίηση:

Βγάλτε το εγχειρίδιο και διαβάστε το προσεκτικά και κάντε προετοιμασίες πριν από το πείραμα σύμφωνα με τις απαιτήσεις του εγχειριδίου.

Βήμα 4

Προετοιμάστε το σύστημα αντίδρασης PCR

Σύμφωνα με το πειραματικό πρωτόκολλο, αναμειγνύονται ομοιόμορφα οι εκκινητές, H2O και 2×PCR, φυγοκεντρούνται και κατανέμονται σε κάθε σωλήνα αντίδρασης.

Ειδοποίηση:

Για μεγάλης κλίμακας ή μακροχρόνιες δοκιμές, συνιστάται η χρήση συστήματος αντίδρασης PCR που περιέχει ένζυμο UNG, το οποίο μπορεί να αποφύγει αποτελεσματικά τη μόλυνση από αεροζόλ που προκαλείται από προϊόντα PCR.

Βήμα 5

Προσθέστε πρότυπο αντίδρασης

Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία Direct PCR, δεν υπάρχει ανάγκη για κουραστική διαδικασία καθαρισμού νουκλεϊκού οξέος, το πρότυπο δείγμα μπορεί να παρασκευαστεί εντός 10 λεπτών και μπορεί να προστεθεί το αντίστοιχο σύστημα αντίδρασης PCR.

Ειδοποίηση:

Η μέθοδος διάσπασης έχει καλύτερο αποτέλεσμα ανίχνευσης και το λαμβανόμενο προϊόν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για πολλαπλές αντιδράσεις ανίχνευσης.

5.1: Άμεση διαστολή των φύλλων

Σύμφωνα με το μέγεθος της εικόνας στο εγχειρίδιο, κόψτε τον ιστό φύλλου με διάμετρο 2-3 mm και τοποθετήστε τον στο σύστημα αντίδρασης PCR.

Σημείωση: Βεβαιωθείτε ότι τα θραύσματα των φύλλων είναι πλήρως βυθισμένα στο διάλυμα αντίδρασης PCR και μην προσθέσετε υπερβολικό ιστό φύλλων.

5.2: Μέθοδος διαχωρισμού φύλλων

Κόβουμε το φύλλο φύλλου με διάμετρο 5-7mm και το τοποθετούμε σε σωλήνα φυγοκέντρησης.Εάν επιλέξετε ώριμα φύλλα, αποφύγετε τη χρήση των ιστών της κύριας φλέβας του φύλλου.Μεταφέρετε με σιφώνιο 50 ul ρυθμιστικού διαλύματος P1 σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης για να διασφαλίσετε ότι το προϊόν λύσης μπορεί να βυθίσει πλήρως τον ιστό των φύλλων, τοποθετήστε το σε θερμικό κυκλοποιητή ή σε μεταλλικό λουτρό και λύστε στους 95°C για 5-10 λεπτά.

Προσθέστε 50 ul ρυθμιστικού διαλύματος εξουδετέρωσης P2 και ανακατέψτε καλά.Το προκύπτον προϊόν λύσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εκμαγείο και να προστεθεί στο σύστημα αντίδρασης PCR.

Σημείωση: Η ποσότητα του προτύπου είναι μεταξύ 5-10% του συστήματος PCR και δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20% (για παράδειγμα, σε σύστημα PCR 20 μl, προσθέστε 1-2 μl διαλύματος λύσης, όχι περισσότερο από 4 μl).

Βήμα 6

Αντίδραση PCR

Μετά τη φυγοκέντρηση του σωλήνα αντίδρασης PCR, τοποθετείται σε ένα όργανο PCR για ενίσχυση.

Ειδοποίηση:

Η αντίδραση χρησιμοποιεί μη καθαρισμένο εκμαγείο για ενίσχυση, επομένως ο αριθμός των κύκλων ενίσχυσης είναι 5-10 περισσότεροι κύκλοι από ό,τι όταν χρησιμοποιείται καθαρισμένο εκμαγείο DNA.

Βήμα 7

Ανίχνευση ηλεκτροφόρησης και ανάλυση αποτελεσμάτων

M: 100bp DNA Ladder

1\4: Μέθοδος καθαρισμένου DNA

2\5: Μέθοδος άμεσης PCR

3\6: Κενό στοιχείο ελέγχου

QC:

Τα αποτελέσματα των δοκιμών των διαφόρων μαρτύρων που ορίστηκαν στο πείραμα θα πρέπει να πληρούν τις ακόλουθες συνθήκες.Διαφορετικά, θα πρέπει να αναλυθεί η αιτία του προβλήματος και η δοκιμή θα πρέπει να γίνει ξανά αφού εξαλειφθεί το πρόβλημα.

Πίνακας 1. Κανονικά αποτελέσματα δοκιμών διαφόρων ομάδων ελέγχου

*Όταν το πλασμίδιο χρησιμοποιείται ως θετικός έλεγχος, το αποτέλεσμα της δοκιμής ενδογενούς γονιδίου μπορεί να είναι αρνητικό

Αποτέλεσμα κρίσης:

Α. Το αποτέλεσμα της δοκιμής του ενδογενούς γονιδίου του δείγματος είναι αρνητικό, υποδεικνύοντας ότι το DNA που είναι κατάλληλο για συνηθισμένη ανίχνευση PCR δεν μπορεί να εξαχθεί από το δείγμα ή ότι το εξαγόμενο DNA περιέχει αναστολείς αντίδρασης PCR και ότι το DNA πρέπει να εκχυλιστεί ξανά.

Β. Το αποτέλεσμα της δοκιμής του ενδογενούς γονιδίου του δείγματος είναι θετικό και το αποτέλεσμα της δοκιμής του εξωγενούς γονιδίου είναι αρνητικό, υποδεικνύοντας ότι το DNA κατάλληλο για συνηθισμένη ανίχνευση PCR εξάγεται από το δείγμα και μπορεί να κριθεί ότι το γονίδιο XXX δεν ανιχνεύεται στο δείγμα.

Γ. Το αποτέλεσμα της δοκιμής του ενδογενούς γονιδίου του δείγματος είναι θετικό και το αποτέλεσμα της δοκιμής του εξωγενούς γονιδίου είναι θετικό, υποδεικνύοντας ότι το DNA κατάλληλο για συνηθισμένη ανίχνευση PCR έχει εξαχθεί από το δείγμα και το δείγμα DNA περιέχει το γονίδιο XXX.Πειράματα επιβεβαίωσης μπορούν να διεξαχθούν περαιτέρω.

Βήμα 8

Αστάρια ανίχνευσης σχεδίου

Μετά το πείραμα, χρησιμοποιήστε διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 2% και διάλυμα αιθανόλης 70% για να σκουπίσετε την περιοχή του πειράματος για να αποτρέψετε τη μόλυνση του περιβάλλοντος.