ΣΦΑΙΡΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ
Ταχεία αναγνώριση διαγονιδιακών φυτών
Κείμενο/Tong Yucheng
Πειραματική λειτουργία/Χαν Γινγκ
Συντάκτης/Wen Youjun
Λέξεις/1600+
Προτεινόμενος χρόνος ανάγνωσης/8-10 λεπτά
Ταχεία αναγνώριση διαγονιδιακών φυτών
Ως νεοεισερχόμενος στο εργαστήριο, δεν είναι καλή δουλειά να ελέγχετε θετικά φυτά από μια δέσμη φυτών με χαμηλό ποσοστό μετατροπής.Αρχικά, το DNA πρέπει να εξαχθεί από μεγάλο αριθμό δειγμάτων ένα προς ένα και στη συνέχεια τα ξένα γονίδια θα ανιχνευθούν με PCR.Ωστόσο, τα αποτελέσματα είναι συχνά κενά και ζώνες με λίγα στοιχεία περιστασιακά, αλλά είναι αδύνατο να προσδιοριστεί εάν υπάρχουν χαμένες ανιχνεύσεις ή ψευδείς ανιχνεύσεις..Είναι πολύ ανήμπορο να αντιμετωπίζεις μια τέτοια πειραματική διαδικασία και αποτελέσματα;Μην ανησυχείτε, ο αδελφός σας διδάσκει πώς να ελέγχετε τα διαγονιδιακά θετικά φυτά εύκολα και με ακρίβεια.
Βήμα 1: Αστάρια ανίχνευσης σχεδίου
Προσδιορίστε το ενδογενές γονίδιο και το εξωγενές γονίδιο που θα ανιχνευθεί σύμφωνα με το δείγμα που θα δοκιμαστεί και επιλέξτε μια αντιπροσωπευτική αλληλουχία 100-500 bp στο γονίδιο για το σχεδιασμό εκκινητών.Οι καλοί εκκινητές μπορούν να εξασφαλίσουν την ακρίβεια των αποτελεσμάτων ανίχνευσης και να μειώσουν το χρόνο ανίχνευσης (δείτε το παράρτημα για τα ευρέως χρησιμοποιούμενα εκκινητές ανίχνευσης).
Σημείωση:
Οι νεοσχεδιασμένοι εκκινητές πρέπει να βελτιστοποιούν τις συνθήκες αντίδρασης και να επαληθεύουν την ακρίβεια, την ακρίβεια και το όριο ανίχνευσης της ανίχνευσης πριν από την εκτέλεση ανίχνευσης μεγάλης κλίμακας.
Βήμα 2:Αναπτύξτε πειραματικό πρωτόκολλο
Θετικός έλεγχος: Χρησιμοποιήστε το καθαρισμένο DNA που περιέχει το θραύσμα στόχο ως πρότυπο για να προσδιορίσετε εάν το σύστημα και οι συνθήκες αντίδρασης PCR είναι φυσιολογικές.
Αρνητικός/τενός μάρτυρας: Χρησιμοποιήστε ένα πρότυπο DNA ή ddH2O που δεν περιέχει το θραύσμα στόχο ως πρότυπο για την ανίχνευση εάν υπάρχει πηγή μόλυνσης στο σύστημα PCR.
Εσωτερικός έλεγχος αναφοράς: χρησιμοποιήστε τον συνδυασμό εκκινητή/ανιχνευτή του ενδογενούς γονιδίου του προς δοκιμή δείγματος για να αξιολογήσετε εάν το πρότυπο μπορεί να ανιχνευθεί με PCR.
Σημείωση:
Θα πρέπει να ορίζονται θετικοί, αρνητικοί/τυφλοί έλεγχοι και έλεγχοι εσωτερικού ελέγχου για κάθε δοκιμή για την αξιολόγηση της εγκυρότητας των πειραματικών αποτελεσμάτων.
Βήμα 3: Προετοιμασία πειράματος
Πριν από τη χρήση, παρατηρήστε εάν το διάλυμα έχει αναμειχθεί ομοιόμορφα.Εάν εντοπιστεί καθίζηση, πρέπει να διαλυθεί και να αναμειχθεί σύμφωνα με τις οδηγίες πριν από τη χρήση.Το μείγμα 2×PCR πρέπει να αναμιχθεί με πιπέτα και να αναμιχθεί επανειλημμένα με μικροσιφώνιο πριν από τη χρήση για να αποφευχθεί η άνιση κατανομή ιόντων.
Σημείωση:
Βγάλτε τις οδηγίες και διαβάστε τις προσεκτικά και κάντε προετοιμασίες πριν από το πείραμα σύμφωνα με τις οδηγίες.
Βήμα 4: Προετοιμάστε το σύστημα αντίδρασης PCR
Σύμφωνα με το πειραματικό πρωτόκολλο, αναμίξτε τους εκκινητές, H2O, 2×PCR αναμειγνύονται, φυγοκεντρούνται και κατανέμονται σε κάθε σωλήνα αντίδρασης.
Σημείωση:
Για μεγάλης κλίμακας ή μακροχρόνιες δοκιμές, συνιστάται η χρήση συστήματος αντίδρασης PCR που περιέχει ένζυμο UNG, το οποίο μπορεί να αποφύγει αποτελεσματικά τη μόλυνση από αεροζόλ που προκαλείται από προϊόντα PCR.
Βήμα 5: Προσθέστε πρότυπο αντίδρασης
Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία Direct PCR, δεν υπάρχει ανάγκη για κουραστική διαδικασία καθαρισμού νουκλεϊκού οξέος.Το πρότυπο δείγμα μπορεί να παρασκευαστεί εντός 10 λεπτών και να προστεθεί στο αντίστοιχο σύστημα αντίδρασης PCR.
Σημείωση:
Η μέθοδος Lysis έχει καλύτερο αποτέλεσμα ανίχνευσης και το λαμβανόμενο προϊόν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για πολλαπλές αντιδράσεις ανίχνευσης.
5.1: Απευθείας PCR των φύλλων
Σύμφωνα με το μέγεθος της εικόνας στο εγχειρίδιο, κόψτε τον ιστό φύλλου με διάμετρο 2-3 mm και τοποθετήστε τον στο σύστημα αντίδρασης PCR.
Σημείωση: Βεβαιωθείτε ότι τα θραύσματα των φύλλων είναι πλήρως βυθισμένα στο διάλυμα αντίδρασης PCR και μην προσθέσετε υπερβολικό ιστό φύλλων.
5.2: Μέθοδος λύσης φύλλων
Κόβουμε το φύλλο φύλλου με διάμετρο 5-7mm και το τοποθετούμε σε σωλήνα φυγοκέντρησης.Εάν επιλέξετε ώριμα φύλλα, αποφύγετε τη χρήση των ιστών της κύριας φλέβας του φύλλου.Μεταφέρετε με σιφώνιο 50 ul ρυθμιστικού διαλύματος P1 σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης για να διασφαλίσετε ότι το προϊόν λύσης μπορεί να βυθίσει πλήρως τον ιστό των φύλλων, τοποθετήστε το σε θερμικό κυκλοποιητή ή σε μεταλλικό λουτρό και λύστε στους 95°C για 5-10 λεπτά.
Προσθέστε 50 ul ρυθμιστικού διαλύματος εξουδετέρωσης P2 και ανακατέψτε καλά.Το προκύπτον προϊόν λύσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εκμαγείο και να προστεθεί στο σύστημα αντίδρασης PCR.
Σημείωση: Η ποσότητα του προτύπου πρέπει να είναι μεταξύ 5-10% του συστήματος PCR και δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20% (για παράδειγμα, σε ένα σύστημα PCR 20 μl, προσθέστε 1-2 μl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, όχι περισσότερο από 4 μl).
Βήμα 6: Αντίδραση PCR
Μετά τη φυγοκέντρηση του σωλήνα αντίδρασης PCR, τοποθετήστε τα σε ένα όργανο PCR για ενίσχυση.
Σημείωση:
Η αντίδραση χρησιμοποιεί μη καθαρισμένο εκμαγείο για ενίσχυση, επομένως ο αριθμός των κύκλων ενίσχυσης είναι 5-10 περισσότεροι κύκλοι από ό,τι όταν χρησιμοποιείται καθαρισμένο εκμαγείο DNA.
Βήμα 7: Ανίχνευση ηλεκτροφόρησης και ανάλυση αποτελεσμάτων
M: 100bp DNA Ladder
1\4: Μέθοδος καθαρισμένου DNA
2\5: Μέθοδος άμεσης PCR
3\6: Κενό στοιχείο ελέγχου
Ελεγχος ποιότητας:
Τα αποτελέσματα των δοκιμών των διαφόρων μαρτύρων που ορίστηκαν στο πείραμα θα πρέπει να πληρούν τις ακόλουθες συνθήκες.Διαφορετικά, θα πρέπει να αναλυθεί η αιτία του προβλήματος και η δοκιμή θα πρέπει να γίνει ξανά αφού εξαλειφθεί το πρόβλημα.
Πίνακας 1. Κανονικά αποτελέσματα δοκιμών διαφόρων ομάδων ελέγχου
*Όταν το πλασμίδιο χρησιμοποιείται ως θετικός έλεγχος, το αποτέλεσμα της δοκιμής ενδογενούς γονιδίου μπορεί να είναι αρνητικό
Αποτέλεσμα κρίσης:
Α. Το αποτέλεσμα της δοκιμής του ενδογενούς γονιδίου του δείγματος είναι αρνητικό, υποδεικνύοντας ότι το DNA που είναι κατάλληλο για συνηθισμένη ανίχνευση PCR δεν μπορεί να εξαχθεί από το δείγμα ή ότι το εξαγόμενο DNA περιέχει αναστολείς αντίδρασης PCR και ότι το DNA πρέπει να εκχυλιστεί ξανά.
Β. Το αποτέλεσμα της δοκιμής του ενδογενούς γονιδίου του δείγματος είναι θετικό και το αποτέλεσμα της δοκιμής του εξωγενούς γονιδίου είναι αρνητικό, υποδεικνύοντας ότι το DNA που είναι κατάλληλο για συνηθισμένη ανίχνευση PCR εξάγεται από το δείγμα και μπορεί να κριθεί ότι το γονίδιο XXX δεν ανιχνεύεται στο δείγμα.
Γ. Το αποτέλεσμα της δοκιμής του ενδογενούς γονιδίου του δείγματος είναι θετικό και το αποτέλεσμα της δοκιμής του εξωγενούς γονιδίου είναι θετικό, υποδεικνύοντας ότι το DNA που είναι κατάλληλο για συνηθισμένη ανίχνευση PCR έχει εξαχθεί από το δείγμα και το δείγμα DNA περιέχει το γονίδιο XXX.Πειράματα επιβεβαίωσης μπορούν να διεξαχθούν περαιτέρω.
Βήμα 8: Σχεδιασμός εκκινητών ανίχνευσης
Μετά το πείραμα, χρησιμοποιήστε διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 2% και διάλυμα αιθανόλης 70% για να σκουπίσετε την περιοχή του πειράματος για να αποτρέψετε τη μόλυνση του περιβάλλοντος.
παράρτημα
Πίνακας 2. Συνήθως χρησιμοποιούμενοι εκκινητές για γενική ανίχνευση PCR γενετικά τροποποιημένων φυτών
Εγγραφο αναφοράς:
SN/T 1202-2010, Μέθοδος ανίχνευσης ποιοτικής PCR για γενετικά τροποποιημένα φυτικά συστατικά σε τρόφιμα.
Υπουργείο Γεωργίας Ανακοίνωση 1485-5-2010, Έλεγχος συστατικών γενετικά τροποποιημένων φυτών και προϊόντων τους-ρυζιού Μ12 και παραγώγων του.
Ώρα δημοσίευσης: Jun-09-2021
