一, Αυξήστε την ευαισθησία του συστήματος αντίδρασης:

1. Απομόνωση υψηλής ποιότητας RNA：

Η επιτυχής σύνθεση cDNA προέρχεται από υψηλής ποιότητας RNA.Το υψηλής ποιότητας RNA θα πρέπει τουλάχιστον να είναι πλήρους μήκους και χωρίς αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφάσης όπως το EDTA ή το SDS.Η ποιότητα του RNA καθορίζει τη μέγιστη ποσότητα πληροφοριών αλληλουχίας που μπορείτε να μεταγράψετε σε cDNA.Μια κοινή μέθοδος καθαρισμού RNA είναι μια μέθοδος ενός σταδίου που χρησιμοποιεί ισοθειοκυανική γουανιδίνη/όξινη φαινόλη.Για να αποφευχθεί η μόλυνση από ίχνη RNase, το RNA που απομονώνεται από δείγματα πλούσια σε RNase (όπως το πάγκρεας) πρέπει να αποθηκευτεί σε φορμαλδεΰδη για να διατηρηθεί το υψηλής ποιότητας RNA, ειδικά για μακροχρόνια αποθήκευση.Το RNA που εκχυλίστηκε από το ήπαρ αρουραίου βασικά αποικοδομήθηκε αφού αποθηκεύτηκε σε νερό για μία εβδομάδα, ενώ το RNA που εκχυλίστηκε από σπλήνα αρουραίου παρέμεινε σταθερό μετά από αποθήκευση σε νερό για 3 χρόνια.Επιπλέον, μεταγραφές με μήκος μεγαλύτερο από 4 kb είναι πιο ευαίσθητες στην αποικοδόμηση από ίχνη RNases από τις μικρές μεταγραφές.Για να αυξηθεί η σταθερότητα των αποθηκευμένων δειγμάτων RNA, το RNA μπορεί να διαλυθεί σε απιονισμένο φορμαμίδιο και να αποθηκευτεί στους -70°C.Το φορμαμίδιο που χρησιμοποιείται για τη διατήρηση του RNA πρέπει να είναι απαλλαγμένο από υπολείμματα που αποικοδομούν το RNA.Το RNA από το πάγκρεας μπορεί να διατηρηθεί σε φορμαμίδη για τουλάχιστον ένα χρόνο.Όταν προετοιμάζεστε να χρησιμοποιήσετε RNA, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε την ακόλουθη μέθοδο για να κατακρημνίσετε RNA: προσθέστε NaCl σε 0,2Μ και 4 φορές τον όγκο αιθανόλης, τοποθετήστε σε θερμοκρασία δωματίου για 3-5 λεπτά και φυγοκεντρήστε στα 10.000×g για 5 λεπτά.

2. Χρησιμοποιήστε την αντίστροφη μεταγραφάση ανενεργή RNaseH (RNaseH-):

Οι αναστολείς RNase προστίθενται συχνά σε αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής για να αυξηθεί το μήκος και η απόδοση της σύνθεσης cDNA.Αναστολείς RNase θα πρέπει να προστίθενται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης σύνθεσης του πρώτου κλώνου παρουσία ενός ρυθμιστικού και ενός αναγωγικού παράγοντα (όπως DTT), επειδή η διαδικασία πριν από τη σύνθεση cDNA μετουσιώνει τον αναστολέα, απελευθερώνοντας έτσι δεσμευμένη RNase που μπορεί να αποικοδομήσει το RNA.Οι αναστολείς της πρωτεΐνης RNase εμποδίζουν μόνο την αποικοδόμηση του RNA από τη RNase A, B, C και δεν εμποδίζουν τη RNase στο δέρμα, επομένως προσέξτε να μην εισάγετε RNase από τα δάχτυλά σας παρά τη χρήση αυτών των αναστολέων.

Η αντίστροφη μεταγραφάση καταλύει τη μετατροπή του RNA σε cDNA.Τόσο το M-MLV όσο και το AMV έχουν ενδογενή δράση RNaseH επιπλέον της δικής τους δράσης πολυμεράσης.Η δραστηριότητα RNaseH και η δραστηριότητα πολυμεράσης ανταγωνίζονται μεταξύ τους για τον υβριδικό κλώνο που σχηματίζεται μεταξύ του εκμαγείου RNA και του εκκινητή DNA ή του κλώνου επέκτασης cDNA και αποικοδομούν τον κλώνο RNA στο σύμπλεγμα RNA:DNA.Το εκμαγείο RNA που αποικοδομείται από τη δραστηριότητα RNaseH δεν μπορεί πλέον να χρησιμεύσει ως αποτελεσματικό υπόστρωμα για τη σύνθεση cDNA, γεγονός που μειώνει την απόδοση και το μήκος της σύνθεσης cDNA.Ως εκ τούτου, θα ήταν ωφέλιμο να εξαλειφθεί ή να μειωθεί σημαντικά η δραστηριότητα RNaseH της ανάστροφης μεταγραφάσης.

Η αντίστροφη μεταγραφάση SuperScript Ⅱ, η ανάστροφη μεταγραφάση RNaseH-MMLV και η αντίστροφη μεταγραφάση thermoScript, RNaseH- AMV, μπορούν να λάβουν μεγαλύτερη ποσότητα και μεγαλύτερο cDNA πλήρους μήκους από τα MMLV και AMV.Η ευαισθησία RT-PCR θα επηρεαστεί από την ποσότητα της σύνθεσης cDNA.Το ThermoScript είναι πολύ πιο ευαίσθητο από το AMV.Το μέγεθος των προϊόντων RT-PCR περιορίζεται από την ικανότητα της αντίστροφης μεταγραφάσης να συνθέτει cDNA, ειδικά όταν κλωνοποιούνται μεγαλύτερα cDNA.Σε σύγκριση με το MMLV, το SuperScripⅡ αύξησε σημαντικά την απόδοση των προϊόντων μακράς διάρκειας RT-PCR.Η αντίστροφη μεταγραφάση RNaseH έχει επίσης αυξημένη θερμοσταθερότητα, επομένως η αντίδραση μπορεί να πραγματοποιηθεί σε θερμοκρασίες υψηλότερες από τις κανονικές 37-42°C.Κάτω από τις προτεινόμενες συνθήκες σύνθεσης, χρησιμοποιήστε εκκινητή oligo(dT) και 10 μCi [α-P]dCTP.Η συνολική απόδοση του πρώτου κλώνου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο κατακρήμνισης TCA.Πλήρους μήκους cDNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ταινίες ταξινομημένες κατά μέγεθος που αποκόπηκαν και μετρήθηκαν σε ένα πήκτωμα αλκαλικής αγαρόζης.

3. Αυξήστε τη θερμοκρασία επώασης για αντίστροφη μεταγραφή:

Μια υψηλότερη θερμοκρασία επώασης βοηθά στο άνοιγμα της δευτερογενούς δομής του RNA, αυξάνοντας την απόδοση της αντίδρασης.Για τα περισσότερα εκμαγεία RNA, η επώαση του RNA και των εκκινητών στους 65°C χωρίς ρυθμιστικό ή αλάτι, ακολουθούμενη από ταχεία ψύξη στον πάγο θα εξαλείψει τις περισσότερες δευτερεύουσες δομές και θα επιτρέψει στους εκκινητές να συνδεθούν.Ωστόσο, ορισμένα πρότυπα εξακολουθούν να έχουν δευτερεύουσες δομές, ακόμη και μετά από μετουσίωση θερμότητας.Η ενίσχυση αυτών των δύσκολων προτύπων μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση ThermoScript και τοποθετώντας την αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής σε υψηλότερη θερμοκρασία για βελτίωση της ενίσχυσης.Οι υψηλότερες θερμοκρασίες επώασης μπορούν επίσης να αυξήσουν την εξειδίκευση, ειδικά όταν χρησιμοποιούνται ειδικοί για το γονίδιο εκκινητές (GSP) για τη σύνθεση cDNA (βλ. Κεφάλαιο 3).Εάν χρησιμοποιείτε GSP, βεβαιωθείτε ότι το Tm των εκκινητών είναι το ίδιο με την αναμενόμενη θερμοκρασία επώασης.Μην χρησιμοποιείτε oligo(dT) και τυχαίους εκκινητές πάνω από 60°C.Οι τυχαίοι εκκινητές απαιτούν επώαση στους 25°C για 10 λεπτά πριν αυξηθούν στους 60°C.Εκτός από τη χρήση υψηλότερης θερμοκρασίας αντίστροφης μεταγραφής, η εξειδίκευση μπορεί επίσης να βελτιωθεί με απευθείας μεταφορά του μίγματος RNA/primer από τη θερμοκρασία μετουσίωσης 65°C στη θερμοκρασία επώασης αντίστροφης μεταγραφής και προσθήκη ενός προθερμασμένου μίγματος αντίδρασης 2x (σύνθεση εν θερμώ cDNA) .Αυτή η προσέγγιση βοηθά στην αποτροπή του διαμοριακού ζεύγους βάσεων που συμβαίνει σε χαμηλότερες θερμοκρασίες.Η πολλαπλή εναλλαγή θερμοκρασίας που απαιτείται για την RT-PCR μπορεί να απλοποιηθεί χρησιμοποιώντας έναν θερμικό κυκλοποιητή.

Η θερμοσταθερή πολυμεράση Tth δρα ως πολυμεράση DNA παρουσία Mg2+ και ως πολυμεράση RNA παρουσία Mn2+.Μπορεί να διατηρηθεί ζεστό σε μέγιστη θερμοκρασία 65°C.Ωστόσο, η παρουσία Mn2+ κατά τη διάρκεια της PCR μειώνει την πιστότητα, γεγονός που καθιστά την πολυμεράση Tth λιγότερο κατάλληλη για ενίσχυση υψηλής ακρίβειας, όπως η κλωνοποίηση του cDNA.Επιπλέον, η Tth έχει χαμηλή απόδοση αντίστροφης μεταγραφής, η οποία μειώνει την ευαισθησία και, καθώς η αντίστροφη μεταγραφή και η PCR μπορούν να πραγματοποιηθούν με ένα μόνο ένζυμο, οι αντιδράσεις ελέγχου χωρίς αντίστροφη μεταγραφή δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη σύγκριση προϊόντων ενίσχυσης cDNA με μολυσμένο γονιδιωματικό DNA.Τα προϊόντα ενίσχυσης διαχωρίστηκαν.

4. Πρόσθετα που προάγουν την αντίστροφη μεταγραφή:

Πρόσθετα, συμπεριλαμβανομένης της γλυκερόλης και του DMSO προστίθενται στην αντίδραση σύνθεσης του πρώτου κλώνου, η οποία μπορεί να μειώσει τη σταθερότητα του διπλού κλώνου νουκλεϊκού οξέος και να λύσει τη δευτερογενή δομή του RNA.Μπορεί να προστεθεί έως και 20% γλυκερίνη ή 10% DMSO χωρίς να επηρεαστεί η δραστηριότητα SuperScript II ή MMLV.Το AMV μπορεί επίσης να ανεχθεί έως και 20% γλυκερίνη χωρίς απώλεια δραστηριότητας.Προκειμένου να μεγιστοποιηθεί η ευαισθησία της RT-PCR στην αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής SuperScriptⅡ, μπορεί να προστεθεί 10% γλυκερόλη και να επωαστεί στους 45°C.Εάν το 1/10 του προϊόντος της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής προστεθεί στην PCR, τότε η συγκέντρωση της γλυκερίνης στην αντίδραση ενίσχυσης είναι 0,4%, η οποία δεν αρκεί για την αναστολή της PCR.

5. Θεραπεία RNaseH:

Η θεραπεία των αντιδράσεων σύνθεσης cDNA με RNaseH πριν από την PCR μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία.Για ορισμένα πρότυπα, πιστεύεται ότι το RNA στην αντίδραση σύνθεσης cDNA αποτρέπει τη σύνδεση προϊόντων ενίσχυσης, οπότε η θεραπεία με RNaseH μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία.Γενικά, η θεραπεία με RNaseH είναι απαραίτητη όταν ενισχύονται πλήρους μήκους πρότυπα cDNA στόχου, όπως η κονδυλώδης σκέρωση II χαμηλού αντιγράφου.Για αυτό το δύσκολο πρότυπο, η επεξεργασία RNaseH ενίσχυσε το σήμα που παράγεται από το SuperScript II ή το cDNA που συντίθεται με AMV.Για τις περισσότερες αντιδράσεις RT-PCR, η θεραπεία με RNaseH είναι προαιρετική, επειδή το στάδιο μετουσίωσης PCR στους 95°C γενικά υδρολύει το RNA στο σύμπλεγμα RNA:DNA.

6. Βελτίωση της μεθόδου ανίχνευσης μικρού RNA:

Η RT-PCR είναι ιδιαίτερα δύσκολη όταν είναι διαθέσιμες μόνο μικρές ποσότητες RNA.Το γλυκογόνο που προστίθεται ως φορέας κατά την απομόνωση RNA βοηθά στην αύξηση της απόδοσης μικρών δειγμάτων.Το γλυκογόνο χωρίς RNase μπορεί να προστεθεί ταυτόχρονα με την προσθήκη Trizol.Το γλυκογόνο είναι υδατοδιαλυτό και μπορεί να διατηρηθεί στην υδατική φάση με RNA για να βοηθήσει την επακόλουθη καθίζηση.Για δείγματα λιγότερα από 50 mg ιστού ή 106 καλλιεργημένα κύτταρα, η συνιστώμενη συγκέντρωση γλυκογόνου χωρίς RNase είναι 250 μg/ml.

Η προσθήκη ακετυλιωμένου BSA στην αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής χρησιμοποιώντας το SuperScript II μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία και για μικρές ποσότητες RNA, η μείωση της ποσότητας του SuperScript II και η προσθήκη 40 μονάδων αναστολέα νουκλεάσης RNaseOut μπορεί να αυξήσει το επίπεδο ανίχνευσης.Εάν χρησιμοποιείται γλυκογόνο στη διαδικασία απομόνωσης RNA, εξακολουθεί να συνιστάται η προσθήκη αναστολέα BSA ή RNase όταν χρησιμοποιείται το SuperScript II για αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής.

二、Αύξηση της ειδικότητας RT-PCR

1. Ασύνθεση CND:

Η σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA μπορεί να ξεκινήσει χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές μεθόδους, η σχετική ειδικότητα των οποίων επηρεάζει την ποσότητα και τον τύπο του cDNA που συντίθεται.

Η μέθοδος τυχαίου εκκινητή ήταν η λιγότερο ειδική από τις τρεις μεθόδους.Οι εκκινητές ανόπτονται σε πολλαπλές θέσεις σε όλο το μεταγράφημα, δημιουργώντας σύντομα cDNA μερικού μήκους.Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται συχνά για τη λήψη ακραίων αλληλουχιών 5' και για τη λήψη cDNA από μήτρες RNA με περιοχές δευτεροταγούς δομής ή με θέσεις τερματισμού που δεν μπορούν να αντιγραφούν από την αντίστροφη μεταγραφάση.Για να ληφθεί το μεγαλύτερο cDNA, η αναλογία εκκινητών προς RNA σε κάθε δείγμα RNA πρέπει να προσδιοριστεί εμπειρικά.Η αρχική συγκέντρωση των τυχαίων εκκινητών κυμαινόταν από 50 έως 250 ng ανά 20 μl αντίδρασης.Εφόσον το cDNA που συντίθεται από ολικό RNA χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές είναι κυρίως ριβοσωμικό RNA, το πολυ(Α)+RNA επιλέγεται γενικά ως εκμαγείο.

Οι εκκινητές ολιγο(dT) είναι πιο συγκεκριμένοι από τους τυχαίους εκκινητές.Υβριδίζεται με την ουρά πολυ(Α) που βρίσκεται στο 3' άκρο των περισσότερων ευκαρυωτικών mRNA.Επειδή το πολυ(Α)+ RNA είναι περίπου 1% έως 2% του συνολικού RNA, η ποσότητα και η πολυπλοκότητα του cDNA είναι πολύ μικρότερη από ό,τι με τους τυχαίους εκκινητές.Λόγω της υψηλής εξειδίκευσής του, το ολίγο(dT) γενικά δεν απαιτεί βελτιστοποίηση της αναλογίας RNA προς εκκινητές και επιλογή πολυ(Α)+.Συνιστάται η χρήση 0,5μg oligo(dT) ανά σύστημα αντίδρασης 20μl.Το oligo(dT)12-18 είναι κατάλληλο για τις περισσότερες RT-PCR.Το σύστημα ThermoScript RT-PCR προσφέρει oligo(dT)20 λόγω της καλύτερης θερμικής σταθερότητάς του για υψηλότερες θερμοκρασίες επώασης.

Οι ειδικοί εκκινητές γονιδίου (GSP) είναι οι πιο ειδικοί εκκινητές για το στάδιο της αντίστροφης μεταγραφής.Το GSP είναι ένα αντιπληροφοριακό ολιγονουκλεοτίδιο που μπορεί να υβριδοποιηθεί ειδικά με την αλληλουχία-στόχο RNA, σε αντίθεση με τους τυχαίους εκκινητές ή τα ολιγο(dT), τα οποία ανόπτονται σε όλα τα RNA.Οι ίδιοι κανόνες που χρησιμοποιούνται για το σχεδιασμό εκκινητών PCR ισχύουν για το σχεδιασμό του GSP σε αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής.Το GSP μπορεί να είναι η ίδια αλληλουχία με τον εκκινητή ενίσχυσης που ανόπτεται στο 3'-άκρο του mRNA ή το GSP μπορεί να σχεδιαστεί για να ανόπτεται κατάντη του εκκινητή αντίστροφης ενίσχυσης.Για ορισμένα ενισχυμένα υποκείμενα, πρέπει να σχεδιαστούν περισσότεροι από ένας αντιπληροφοριακός εκκινητής για επιτυχή RT-PCR επειδή η δευτερογενής δομή του RNA στόχου μπορεί να αποτρέψει τη δέσμευση εκκινητών.Συνιστάται η χρήση 1 pmol αντιπληροφοριακού GSP σε μια αντίδραση σύνθεσης πρώτου κλώνου 20 μl.

2. Αυξήστε τη θερμοκρασία επώασης για αντίστροφη μεταγραφή:

Προκειμένου να αξιοποιηθεί πλήρως το πλήρες πλεονέκτημα της ειδικότητας του GSP, θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί μια αντίστροφη μεταγραφάση με υψηλότερη θερμοσταθερότητα.Οι θερμοσταθερές αντίστροφες μεταγραφάσες μπορούν να επωαστούν σε υψηλότερες θερμοκρασίες για να αυξηθεί η αυστηρότητα της αντίδρασης.Για παράδειγμα, εάν ένα GSP ανόπτεται στους 55°C, η εξειδίκευση του GSP δεν θα χρησιμοποιηθεί πλήρως εάν το AMV ή το M-MLV χρησιμοποιείται για αντίστροφη μεταγραφή σε χαμηλή αυστηρότητα 37°C.Ωστόσο, το SuperScript II και το ThermoScript μπορούν να αντιδράσουν στους 50°C ή υψηλότερα, γεγονός που θα εξαλείψει τα μη ειδικά προϊόντα που παράγονται σε χαμηλότερες θερμοκρασίες.Για μέγιστη εξειδίκευση, το μίγμα RNA/primer μπορεί να μεταφερθεί απευθείας από τη θερμοκρασία μετουσίωσης 65°C στη θερμοκρασία επώασης αντίστροφης μεταγραφής και να προστεθεί σε ένα προθερμασμένο μίγμα αντίδρασης 2× (θερμή έναρξη σύνθεσης cDNA).Αυτό βοηθά στην αποφυγή του διαμοριακού ζευγαρώματος βάσεων σε χαμηλές θερμοκρασίες.Οι πολλαπλές μεταβάσεις θερμοκρασίας που απαιτούνται για την RT-PCR μπορούν να απλοποιηθούν χρησιμοποιώντας έναν θερμικό κυκλοποιητή.

3. Μειώνει τη μόλυνση του γονιδιωματικού DNA:

Μια πιθανή δυσκολία που συναντάται με την RT-PCR είναι η μόλυνση του γονιδιωματικού DNA στο RNA.Η χρήση μιας καλής μεθόδου απομόνωσης RNA, όπως το αντιδραστήριο Trizol, θα μειώσει την ποσότητα του γονιδιωματικού DNA που μολύνει το παρασκεύασμα RNA.Για να αποφευχθούν προϊόντα που προέρχονται από γονιδιωματικό DNA, το RNA μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία με DNase I βαθμού ενίσχυσης για την απομάκρυνση του μολυσμένου DNA πριν από την αντίστροφη μεταγραφή.Η πέψη με ϋΝάση Ι τερματίστηκε με επώαση των δειγμάτων σε 2,0 mM EDTA για 10 λεπτά στους 65°C.Το EDTA μπορεί να χηλώσει ιόντα μαγνησίου, αποτρέποντας την υδρόλυση RNA που εξαρτάται από ιόντα μαγνησίου σε υψηλές θερμοκρασίες.

Προκειμένου να διαχωριστεί το ενισχυμένο cDNA από τα μολυσματικά προϊόντα ενίσχυσης γονιδιωματικού DNA, μπορούν να σχεδιαστούν εκκινητές που ο καθένας ανόπτει σε διαχωρισμό εξονίων.Τα προϊόντα PCR που προέρχονται από cDNA θα είναι μικρότερα από εκείνα που προέρχονται από μολυσμένο γονιδιωματικό DNA.Επιπλέον, ένα πείραμα ελέγχου χωρίς αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε σε κάθε εκμαγείο RNA για να προσδιοριστεί εάν ένα δεδομένο θραύσμα προήλθε από γονιδιωματικό DNA ή cDNA.Το προϊόν PCR που λαμβάνεται χωρίς αντίστροφη μεταγραφή προέρχεται από το γονιδίωμα.