Ⅰ. Αυξήστε την ευαισθησία του συστήματος αντίδρασης:

1. Διαχωρίστε RNA υψηλής ποιότητας:

Η επιτυχής σύνθεση cDNA προέρχεται από υψηλής ποιότητας RNA.Το υψηλής ποιότητας RNA θα πρέπει να εξασφαλίζει τουλάχιστον συνολική διάρκεια και δεν περιέχει αναστολείς που δεν περιέχουν ένζυμα εγγραφής, όπως EDTA ή SDS.Η ποιότητα του RNA καθορίζει τη μέγιστη τιμή των πληροφοριών αλληλουχίας που μπορείτε να μεταγράψετε στο cDNA.Η γενική μέθοδος καθαρισμού RNA είναι μια σταδιακή μέθοδος χρήσης ισοκυανικού/οξεοφαινόλης.Προκειμένου να αποφευχθεί η μόλυνση της RNase, το RNA που διαχωρίζεται από ένα δείγμα πλούσιο σε RNase (όπως το πάγκρεας) απαιτεί αποθήκευση φορμαλδεΰδης για εξοικονόμηση RNA υψηλής ποιότητας, κάτι που ισχύει ακόμη περισσότερο για μακροχρόνια αποθήκευση.Το RNA που εκχυλίστηκε από το ήπαρ του αρουραίου βασικά αποικοδομήθηκε μετά από μία εβδομάδα αποθήκευσης σε νερό, ενώ το RNA που εκχυλίστηκε από τη σπλήνα του αρουραίου παρέμεινε σταθερό μετά από τρία χρόνια αποθήκευσης σε νερό.Επιπλέον, μεταγραφές μεγαλύτερες από 4 kb είναι πιο ευαίσθητες στην ιχνηλάτηση της αποικοδόμησης RNase από τις μικρές μεταγραφές.Προκειμένου να αυξηθεί η σταθερότητα του αποθηκευτικού δείγματος RNA, το RNA μπορεί να διαλυθεί σε ιόντα μεθαλμαμίνης και αποθηκεύεται στους -70 °C.Το θυλίδιο που χρησιμοποιείται για την εξοικονόμηση RNA δεν πρέπει να περιέχει διάφορα αντικείμενα που διασπούν το RNA.Το RNA, το οποίο προέρχεται από το πάγκρεας, μπορεί να διατηρηθεί σε μεθαλμαμίνη για τουλάχιστον ένα χρόνο.Όταν είστε έτοιμοι να χρησιμοποιήσετε RNA, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε τις ακόλουθες μεθόδους για να κατακρημνίσετε RNA: προσθέστε NaCl σε 0,2 m και 4 φορές τον όγκο της αιθανόλης, τοποθετήστε τη θερμοκρασία δωματίου για 3-5 λεπτά και 10.000 × g φυγοκεντρήστε για 5 λεπτά.

2. Χρησιμοποιήστε αντίστροφη μεταγραφάση χωρίς δραστηριότητα RNaseH (RNaseH-)：

Οι αναστολείς RNase προστίθενται συχνά σε αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής για να αυξηθεί το μήκος και η απόδοση της σύνθεσης cDNA.Ο αναστολέας RNase προστίθεται στην πρώτη αντίδραση σύνθεσης αλυσίδας παρουσία ρυθμιστικών και αναγωγικών παραγόντων όπως το DTT επειδή η διαδικασία σύνθεσης πριν από το cDNA μετουσιώνει τον αναστολέα, απελευθερώνοντας έτσι δεσμευμένες RNases που αποικοδομούν το RNA.Ο αναστολέας πρωτεΐνης RNase αποτρέπει μόνο την αποικοδόμηση του RNA από RNase A, B, C και δεν αποτρέπει τις RNases στο δέρμα, επομένως πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να μην εισαχθούν RNases από τα δάχτυλα παρά τη χρήση αυτών των αναστολέων.

Η αντίστροφη μεταγραφάση καταλύει τη μετατροπή του RNA σε cDNA.Τόσο το M-MLV όσο και το AMV έχουν ενδογενή δράση RNaseH επιπλέον της δικής τους δράσης πολυμεράσης.Η δραστικότητα RNaseH ανταγωνίζεται τη δράση πολυμεράσης για ετερόζυγους κλώνους που σχηματίζονται μεταξύ εκμαγείων RNA και εκκινητών DNA ή κλώνων επέκτασης cDNA και αποικοδομεί τους κλώνους RNA: RNA σε σύμπλοκα DNA.Τα εκμαγεία RNA που αποικοδομούνται από τη δραστηριότητα RNaseH δεν μπορούν πλέον να χρησιμοποιηθούν ως αποτελεσματικά υποστρώματα για τη σύνθεση cDNA, μειώνοντας την απόδοση και το μήκος της σύνθεσης cDNA.Έτσι, η εξάλειψη ή η μεγάλη μείωση της δραστηριότητας RNaseH της ανάστροφης μεταγραφάσης θα ήταν μεγάλο όφελος.

Η αντίστροφη μεταγραφάση SuperScriptⅡ, η αντίστροφη μεταγραφάση MMLV της RNaseH- και η αντίστροφη μεταγραφάση thermoScript, η AMV της RNaseH- απέδωσαν περισσότερο cDNA πλήρους μήκους από τα MMLV και AMV.Η ευαισθησία RT-PCR επηρεάζεται από την ποσότητα του cDNA που συντίθεται.Το ThermoScript είναι πολύ πιο ευαίσθητο από το AMV.Το μέγεθος των προϊόντων RT-PCR περιορίζεται από την ικανότητα της αντίστροφης μεταγραφάσης να συνθέτει cDNA, ειδικά όταν κλωνοποιούνται μεγαλύτερα Cdnas.Σε σύγκριση με το MMLV, το SuperScripⅡ αύξησε σημαντικά την απόδοση των προϊόντων μακράς διάρκειας RT-PCR.Η αντίστροφη μεταγραφάση της RNaseH- αυξάνει επίσης τη θερμική σταθερότητα, επομένως η αντίδραση μπορεί να πραγματοποιηθεί σε θερμοκρασίες υψηλότερες από τις κανονικές των 37-42℃.Κάτω από τις προτεινόμενες συνθήκες σύνθεσης χρησιμοποιήθηκαν ολιγο(dT) εκκινητές και 10μCi [άλφα-p]dCTP.Η συνολική παραγωγή της πρώτης αλυσίδας υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο κατακρήμνισης TCA.Το πλήρους μήκους cDNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας αφαίρεση λωρίδων ταξινομημένη κατά μέγεθος και μέτρηση σε γέλη αλκαλικής αγαρόζης.

3. Αυξήστε τη θερμοκρασία διατήρησης θερμότητας της αντίστροφης μεταγραφής:

Η υψηλότερη θερμοκρασία διατήρησης βοηθά στο άνοιγμα της δευτερογενούς δομής του RNA και στην αύξηση της απόδοσης της αντίδρασης.Για τα περισσότερα πρότυπα RNA, η διατήρηση του RNA και του εκκινητή στους 65°C χωρίς ρυθμιστικό διάλυμα ή αλάτι και στη συνέχεια η γρήγορη ψύξη τους σε πάγο εξαλείφει τις περισσότερες δευτερεύουσες δομές και επιτρέπει στους εκκινητές να συνδεθούν.Ωστόσο, ορισμένα πρότυπα εξακολουθούν να έχουν δευτερεύουσα δομή, ακόμη και μετά από θερμική μετουσίωση.Η ενίσχυση αυτών των δύσκολων προτύπων μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση ThermoScript και τοποθετώντας την αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης σε υψηλότερες θερμοκρασίες για βελτίωση της ενίσχυσης.Οι υψηλότερες θερμοκρασίες διατήρησης μπορούν επίσης να αυξήσουν την εξειδίκευση, ειδικά όταν η σύνθεση cDNA εκτελείται με τη χρήση ειδικών για γονίδια εκκινητών (GSPS) (βλ. Κεφάλαιο 3).Εάν χρησιμοποιείτε GSP, βεβαιωθείτε ότι η τιμή Tm του ασταριού είναι ίδια με την αναμενόμενη θερμοκρασία διατήρησης.Μην χρησιμοποιείτε oligo(dT) και τυχαίους εκκινητές πάνω από 60℃.Οι τυχαίοι εκκινητές πρέπει να διατηρούνται στους 25℃ για 10 λεπτά πριν αυξηθούν στους 60℃.Εκτός από τη χρήση υψηλότερων θερμοκρασιών αντίστροφης μεταγραφής, η ειδικότητα μπορεί να βελτιωθεί με απευθείας μεταφορά του μίγματος RNA/εκκινητή από τη θερμοκρασία μετουσίωσης 65℃ στη θερμοκρασία διατήρησης της αντίστροφης μεταγραφής και προσθήκη ενός προθερμασμένου μίγματος αντίδρασης 2× (σύνθεση θερμικής εκκίνησης cDNA).Αυτή η προσέγγιση βοηθά στην αποτροπή του διαμοριακού ζεύγους βάσεων που συμβαίνει σε χαμηλότερες θερμοκρασίες.Η χρήση ενός οργάνου PCR απλοποιεί τους πολλούς διακόπτες θερμοκρασίας που απαιτούνται για την RT-PCR.

Η θερμικά σταθεροποιημένη πολυμεράση Tth δρα ως πολυμεράση DNA παρουσία Mg2+ και RNA πολυμεράσης παρουσία Mn2+.Μπορεί να κρατήσει θερμότητα έως και 65℃.Ωστόσο, η παρουσία Mn2+ κατά τη διάρκεια της PCR μειώνει την πιστότητα, γεγονός που καθιστά την πολυμεράση Tth λιγότερο κατάλληλη για ενίσχυση υψηλής ακρίβειας, όπως η κλωνοποίηση cDNA.Επιπλέον, η Tth είναι λιγότερο αποτελεσματική στην αντίστροφη μεταγραφή, η οποία μειώνει την ευαισθησία, και δεδομένου ότι ένα μεμονωμένο ένζυμο μπορεί να εκτελέσει αντίστροφη μεταγραφή και PCR, αντιδράσεις ελέγχου χωρίς αντίστροφη μεταγραφή δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διάκριση των ενισχυμένων προϊόντων του cDNA από αυτά του μολυσμένου γονιδιωματικού DNA.

4. Πρόσθετο που προάγει την αντίστροφη μεταγραφή:

Η προσθήκη προσθέτων, συμπεριλαμβανομένης της γλυκερίνης και του DMSO, στην πρώτη αλυσιδωτή αντίδραση σύνθεσης μπορεί να μειώσει τη σταθερότητα του διπλού κλώνου νουκλεϊκού οξέος και να ξετυλίξει τη δευτερογενή δομή του RNA.Μπορεί να προστεθεί έως και 20% γλυκερίνη ή 10% DMSO χωρίς να επηρεαστεί η δραστηριότητα του SuperScriptⅡ ή του MMLV.Το AMV μπορεί επίσης να ανεχθεί έως και 20% γλυκερίνη χωρίς να μειώνει τη δραστηριότητα.Για να μεγιστοποιηθεί η ευαισθησία της RT-PCR στην αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής SuperScriptⅡ, μπορεί να προστεθεί 10% γλυκερίνη και να μονωθεί στους 45℃.Εάν το 1/10 του προϊόντος αντίδρασης ρετρομεταγραφής προστεθεί στην PCR, η συγκέντρωση της γλυκερίνης στην αντίδραση ενίσχυσης είναι 0,4%, που δεν αρκεί για την αναστολή της PCR.

5. Επεξεργασία RNaseH:

Η ευαισθησία μπορεί να βελτιωθεί με θεραπεία αντιδράσεων σύνθεσης cDNA με RNaseH πριν από την PCR.Για ορισμένα πρότυπα, πιστεύεται ότι το RNA στην αντίδραση σύνθεσης cDNA αποτρέπει τη σύνδεση ενισχυμένων προϊόντων, οπότε η επεξεργασία RNaseH μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία.Γενικά, απαιτείται θεραπεία με RNaseH για την ενίσχυση ενός σχετικά μακρού πλήρους μήκους προτύπου στόχου cDNA, όπως η κονδυλώδης σκέρωσηⅡ με χαμηλό αντίγραφο.Για αυτό το δύσκολο πρότυπο, το RNaseH ενίσχυσε το σήμα που παράγεται από το cDNA που συντίθεται από SuperScriptⅡ ή AMV.Για τις περισσότερες αντιδράσεις RT-PCR, η επεξεργασία RNaseH είναι προαιρετική επειδή το στάδιο μετουσίωσης PCR με μόνωση 95℃ υδρολύει τυπικά το RNA από το σύμπλεγμα RNA: DNA.

6. Βελτιωμένες μέθοδοι για την ανίχνευση μικρών ποσοτήτων RNA:

Η RT-PCR είναι ιδιαίτερα δύσκολη όταν είναι διαθέσιμες μόνο μικρές ποσότητες RNA.Η προσθήκη γλυκογόνου ως φορέα κατά τον διαχωρισμό RNA βοηθά στην αύξηση της απόδοσης μικρών δειγμάτων.Ένα γλυκογόνο χωρίς RNase μπορεί να προστεθεί ταυτόχρονα με το Trizol.Το γλυκογόνο είναι υδατοδιαλυτό και μπορεί να παραμείνει στην υδατική φάση με το RNA για να βοηθήσει στην επακόλουθη καθίζηση.Η συνιστώμενη συγκέντρωση γλυκογόνου χωρίς RNase είναι 250 μg/ml για δείγματα μικρότερα από 50 mg ιστού ή 106 καλλιεργημένων κυττάρων.

Η προσθήκη ακετυλιωμένου BSA σε αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής χρησιμοποιώντας SuperScriptⅡ μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία και για μικρές ποσότητες RNA, η μείωση της ποσότητας SuperScriptⅡ και η προσθήκη 40 μονάδων αναστολέα νουκλεάσης RnaseOut μπορεί να βελτιώσει το επίπεδο ανίχνευσης.Εάν χρησιμοποιείται γλυκογόνο στον διαχωρισμό RNA, συνιστάται η προσθήκη αναστολέων BSA ή RNase για να αντιστρέψουν τις αντιδράσεις μεταγραφής χρησιμοποιώντας SuperScriptⅡ.

Ⅱ. Αυξήστε την ειδικότητα της RT-PCR

1. Σύνθεση cNDA:

Τρεις διαφορετικές μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την έναρξη της σύνθεσης cDNA πρώτου κλώνου και η σχετική ειδικότητα κάθε μεθόδου επηρεάζει την ποσότητα και τον τύπο του cDNA που συντίθεται.

Η μέθοδος τυχαίου εκκινητή είναι η λιγότερο ειδική από τις τρεις μεθόδους.Οι εκκινητές ανόπτονται σε πολλαπλές θέσεις σε όλο το μετάγραφο για να παραχθεί cDNA μικρού, μερικού μήκους.Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται συχνά για τη λήψη 5' τερματικών αλληλουχιών και cDNA από μήτρες RNA με δευτερογενείς δομικές περιοχές ή με τερματικές θέσεις που η αντίστροφη μεταγραφάση δεν μπορεί να αντιγραφεί.Για να ληφθεί το μεγαλύτερο cDNA, η αναλογία εκκινητών προς RNA σε κάθε δείγμα RNA πρέπει να προσδιοριστεί εμπειρικά.Η αρχική συγκέντρωση των τυχαίων εκκινητών κυμαίνεται από 50 έως 250 ng ανά σύστημα αντίδρασης 20 μl.Επειδή το cDNA που συντίθεται από ολικό RNA χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές είναι κυρίως ριβοσωμικό RNA, το πολυ(Α)+RNA επιλέγεται γενικά ως εκμαγείο.

Η έναρξη ολιγο(dT) είναι πιο ειδική από τους τυχαίους εκκινητές.Υβριδίζεται με την ουρά πολυ(Α) που βρίσκεται στο 3' άκρο του mRNA στα περισσότερα ευκαρυωτικά κύτταρα.Επειδή το poly(A)+RNA είναι περίπου 1% έως 2% του συνολικού RNA, η ποσότητα και η πολυπλοκότητα του cDNA είναι πολύ μικρότερη από ό,τι αν χρησιμοποιούνταν τυχαίοι εκκινητές.Λόγω της υψηλής εξειδίκευσής του, το ολίγο(dT) γενικά δεν απαιτεί βελτιστοποίηση για την αναλογία RNA προς εκκινητή και επιλογή πολυ(Α)+.Συνιστάται η χρήση 0,5μg oligo(dT) ανά σύστημα αντίδρασης 20μl.Το oligo(dT)12-18 είναι κατάλληλο για τις περισσότερες RT-PCR.Το σύστημα ThermoScript RT-PCR παρέχει oligo(dT)20 λόγω της καλής θερμικής του σταθερότητας και είναι κατάλληλο για υψηλότερες θερμοκρασίες διατήρησης.

Οι ειδικοί εκκινητές γονιδίου (GSP) είναι οι καλύτεροι ειδικοί εκκινητές για το στάδιο της αντίστροφης μεταγραφής.Το GSP είναι ένας αντιπληροφοριακός ολιγονουκλεοζίτης που μπορεί να υβριδοποιηθεί ειδικά με αλληλουχίες προορισμού RNA, αντί να ανόπτει όλα τα Rnas όπως τυχαίους εκκινητές ή ολίγο(dT).Οι κανόνες που χρησιμοποιούνται για το σχεδιασμό εκκινητών PCR ισχύουν επίσης για το σχεδιασμό αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής GSP.Το GSP μπορεί να είναι η ίδια αλληλουχία με τον εκκινητή ενίσχυσης που ανόπτεται στο τέλος του mRNA3' ή το GSP μπορεί να σχεδιαστεί ώστε να ανόπτεται κατάντη με τον εκκινητή αντίστροφης ενίσχυσης.Για ορισμένα ενισχυμένα αντικείμενα, είναι απαραίτητο να σχεδιαστούν περισσότεροι από ένας αντιπληροφοριακός εκκινητής για επιτυχημένη RT-PCR επειδή η δευτερογενής δομή του RNA στόχου μπορεί να εμποδίσει τη δέσμευση του εκκινητή.Προτείνεται η χρήση 1pmol αντιπληροφοριακού GSP στο πρώτο σύστημα αλυσιδωτής αντίδρασης των 20μl.

2. Αυξήστε τη θερμοκρασία διατήρησης θερμότητας της αντίστροφης μεταγραφής:

Προκειμένου να αξιοποιηθεί πλήρως η ειδικότητα του GSP, θα πρέπει να χρησιμοποιείται η αντίστροφη μεταγραφάση με υψηλή θερμική σταθερότητα.Η σταθερή στη θερμότητα αντίστροφη μεταγραφάση μπορεί να μονωθεί σε υψηλότερες θερμοκρασίες για να αυξηθεί η αυστηρότητα της αντίδρασης.Για παράδειγμα, εάν ένα GSP ανόπτεται στους 55°C, τότε η εξειδίκευση του GSP δεν χρησιμοποιείται πλήρως εάν η αντίστροφη μεταγραφή εκτελείται στους 37°C με χαμηλή αυστηρότητα χρησιμοποιώντας AMV ή M-MLV.Ωστόσο, το SuperScripⅡ και το ThermoScript μπορούν να αντιδράσουν στους 50℃ ή υψηλότερα, γεγονός που εξαλείφει τα μη ειδικά προϊόντα που παράγονται σε χαμηλότερες θερμοκρασίες.Για μέγιστη εξειδίκευση, το μίγμα RNA/ εκκινητή μπορεί να μεταφερθεί απευθείας από τη θερμοκρασία μετουσίωσης 65℃ στη θερμοκρασία διατήρησης της αντίστροφης μεταγραφής με την προσθήκη ενός προθερμασμένου μίγματος αντίδρασης 2 x (θερμική έναρξη της σύνθεσης cDNA).Αυτό βοηθά στην αποφυγή ζευγαρώματος βάσεων μεταξύ μορίων σε χαμηλές θερμοκρασίες.Η χρήση ενός οργάνου PCR απλοποιεί τις πολλές μεταβάσεις θερμοκρασίας που απαιτούνται για την RT-PCR.

3. Μειώστε τη μόλυνση του γονιδιωματικού DNA:

Μια πιθανή δυσκολία με την RT-PCR είναι ότι το RNA μολύνει το γονιδιωματικό DNA.Η χρήση καλύτερων μεθόδων διαχωρισμού RNA, όπως το Trizol Reagent, μειώνει τη μόλυνση του γονιδιωματικού DNA σε παρασκευάσματα RNA.Για να αποφευχθούν προϊόντα που παράγονται από γονιδιωματικό DNA, το RNA μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία με DnasⅠ βαθμού ενίσχυσης για να αφαιρεθεί το μολυσμένο DNA πριν από την αντίστροφη μεταγραφή.Τα δείγματα διατηρήθηκαν στους 65℃ σε 2,0 mM EDTA για 10 λεπτά για να τερματιστεί η πέψη με DNaseⅠ.Το EDTA χηλοποιεί ιόντα μαγνησίου για να αποτρέψει την εξαρτώμενη από ιόντα μαγνησίου υδρόλυση RNA που συμβαίνει σε υψηλές θερμοκρασίες.

Προκειμένου να διαχωριστεί το ενισχυμένο cDNA από το προϊόν ενίσχυσης DNA του γονιδιώματος, μπορούν να σχεδιαστούν εκκινητές που ανόπτονται χωριστά με το διαχωρισμένο εξόνιο.Τα προϊόντα PCR που προέρχονται από cDNA θα είναι μικρότερα από εκείνα που προέρχονται από μολυσμένο γονιδιωματικό DNA.Ένα ελεγχόμενο πείραμα χωρίς αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιείται επίσης σε κάθε πρότυπο RNA για να προσδιοριστεί εάν ένα δεδομένο θραύσμα προέρχεται από γονιδιωματικό DNA ή cDNA.Τα προϊόντα PCR που λαμβάνονται απουσία αντίστροφης μεταγραφής προέρχονται από το γονιδίωμα.

Σχετικό προϊόν

RT-PCR Εύκολο^ᵀᴹI (Ένα Βήμα)

-Το κιτ ενός βήματος επιτρέπει τη διεξαγωγή αντίστροφης μεταγραφής και PCR στον ίδιο σωλήνα.Χρειάζεται μόνο να προσθέσει πρότυπο RNA, ειδικούς εκκινητές PCR και ddH χωρίς RNase₂O.

-Η ποσοτική ανάλυση του RNA σε πραγματικό χρόνο μπορεί να πραγματοποιηθεί γρήγορα και με ακρίβεια.

-Το κιτ χρησιμοποιεί ένα μοναδικό αντιδραστήριο αντίστροφης μεταγραφής Foregene και Foregene HotStar Taq DNA Polymerase σε συνδυασμό με ένα μοναδικό σύστημα αντίδρασης για να βελτιώσει αποτελεσματικά την αποτελεσματικότητα ενίσχυσης και την ειδικότητα της αντίδρασης.

-Το βελτιστοποιημένο σύστημα αντίδρασης κάνει την αντίδραση να έχει υψηλότερη ευαισθησία ανίχνευσης, ισχυρότερη θερμική σταθερότητα και καλύτερη ανοχή.

RT Easy II (With GDNase) Master Premix for First-Strand CDNA Synthesis for Real Time PCR with GDNase

-Αποτελεσματική ικανότητα αφαίρεσης gDNA, η οποία μπορεί να αφαιρέσει το gDNA στο πρότυπο μέσα σε 2 λεπτά.

-Αποτελεσματικό σύστημα αντίστροφης μεταγραφής, χρειάζονται μόνο 15 λεπτά για να ολοκληρωθεί η σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA.

-Σύνθετα πρότυπα: πρότυπα με υψηλό περιεχόμενο GC και σύνθετη δευτερεύουσα δομή μπορούν επίσης να αντιστραφούν με υψηλή απόδοση.

-Σύστημα αντίστροφης μεταγραφής υψηλής ευαισθησίας, τα πρότυπα σε επίπεδο pg μπορούν επίσης να λάβουν cDNA υψηλής ποιότητας.

-Το σύστημα αντίστροφης μεταγραφής έχει υψηλή θερμική σταθερότητα, η βέλτιστη θερμοκρασία αντίδρασης είναι 42℃ και εξακολουθεί να έχει καλή απόδοση αντίστροφης μεταγραφής στους 50℃.