1. Βασικές γνώσεις (αν θέλετε να δείτε το πειραματικό μέρος, μεταφέρετε απευθείας στο δεύτερο μέρος)

Ως αντίδραση παραγώγου της συμβατικής PCR, η Real time PCR παρακολουθεί κυρίως την αλλαγή της ποσότητας του προϊόντος ενίσχυσης σε κάθε κύκλο της αντίδρασης ενίσχυσης PCR σε πραγματικό χρόνο μέσω της αλλαγής του σήματος φθορισμού και αναλύει ποσοτικά το αρχικό πρότυπο μέσω της σχέσης μεταξύ της τιμής ct και της τυπικής καμπύλης .

Τα συγκεκριμένα δεδομένα της RT-PCR είναιγραμμή βάσης, κατώφλι φθορισμούκαιτιμή Ct.

Συνήθεις μέθοδοι επισήμανσης για RT-PCR:

2. Πειραματικά βήματα

2.1 Σχετικά με την πειραματική ομαδοποίηση- πρέπει να υπάρχουν πολλά πηγάδια στην ομάδα και πρέπει να υπάρχουν βιολογικές επαναλήψεις.

2.2 Αρχές σχεδιασμού ασταριού

① Το SiRNA είναι ειδικό για τα είδη και οι αλληλουχίες διαφορετικών ειδών θα είναι διαφορετικές.

②Το SiRNA συσκευάζεται σε λυοφιλοποιημένη σκόνη, η οποία μπορεί να αποθηκευτεί σταθερά για 2-4 εβδομάδες σε θερμοκρασία δωματίου.

2.3 Εργαλεία ή αντιδραστήρια που πρέπει να προετοιμαστούν εκ των προτέρων

2.4 Όσον αφορά τα θέματα που πρέπει να δοθεί προσοχή στα συγκεκριμένα πειραματικά βήματα:

① διαδικασία επιμόλυνσης siRNA

1. Για επιμετάλλωση, μπορείτε να επιλέξετε πλάκα 24 φρεατίων, πλάκα 12 φρεατίων ή πλάκα 6 φρεατίων (η μέση συγκέντρωση RNA που προτείνεται σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 24 φρεατίων είναι περίπου 100-300 ng/uL) και η βέλτιστη πυκνότητα επιμόλυνσης των κυττάρων είναι έως και 60%-80% περίπου

2. Τα βήματα της επιμόλυνσης και οι συγκεκριμένες απαιτήσεις είναι αυστηρά σύμφωνα με τις οδηγίες.

3. Μετά τη διαμόλυνση, τα δείγματα μπορούν να συλλεχθούν εντός 24-72 ωρών για ανίχνευση mRNA (RT-PCR) ή ανίχνευση πρωτεΐνης εντός 48-96 ωρών (WB)

② διαδικασία εξαγωγής RNA

1. Αποτρέψτε τη μόλυνση από εξωγενή ένζυμα.Περιλαμβάνει κυρίως τη χρήση μάσκας και γαντιών αυστηρά.χρησιμοποιώντας αποστειρωμένα άκρα πιπέτας και σωλήνες EP.το νερό που χρησιμοποιείται στο πείραμα πρέπει να είναι Χωρίς RNase.

2. Συνιστάται να κάνετε δύο φορές όπως προτείνεται στο κιτ γρήγορης εκχύλισης, το οποίο θα βελτιώσει πραγματικά την καθαρότητα και την απόδοση.

3. Το απόβλητο υγρό δεν πρέπει να αγγίζει τη στήλη RNA.

③ ποσοτικοποίηση RNA

Αφού εξαχθεί το RNA, μπορεί να ποσοτικοποιηθεί απευθείας με Nanodrop και η ελάχιστη ένδειξη μπορεί να είναι τόσο χαμηλή όσο 10 ng/ul.

④Διαδικασία αντίστροφης μεταγραφής

1. Λόγω της υψηλής ευαισθησίας του RT-qPCR, θα πρέπει να κατασκευαστούν τουλάχιστον 3 παράλληλα φρεάτια για κάθε δείγμα για να αποφευχθεί η υπερβολική διαφορά του επόμενου Ct ή η υπερβολικά μεγάλη SD για στατιστική ανάλυση.

2. Μην καταψύχετε και αποψύχετε το Master mix επανειλημμένα.

3. Κάθε σωλήνας/τρύπα πρέπει να αντικατασταθεί με νέο άκρο!Μην χρησιμοποιείτε συνεχώς το ίδιο ρύγχος πιπέτας για να προσθέτετε δείγματα!

4. Η μεμβράνη που προσαρτήθηκε στην πλάκα των 96 φρεατίων μετά την προσθήκη του δείγματος πρέπει να λειανθεί με μια πλάκα.Είναι καλύτερο να κάνετε φυγοκέντρηση πριν το τοποθετήσετε στο μηχάνημα, έτσι ώστε το υγρό στο τοίχωμα του σωλήνα να μπορεί να ρέει προς τα κάτω και να αφαιρεί τις φυσαλίδες αέρα.

⑤Κοινή ανάλυση καμπύλης

2.5 Σχετικά με την ανάλυση δεδομένων

Η ανάλυση δεδομένων της qPCR μπορεί να χωριστεί σε σχετική ποσοτικοποίηση και απόλυτη ποσοτικοποίηση.Για παράδειγμα, τα κύτταρα στην ομάδα θεραπείας σε σύγκριση με τα κύτταρα στην ομάδα ελέγχου,

Πόσες φορές αλλάζει το mRNA του γονιδίου Χ, αυτό είναι σχετικός ποσοτικός προσδιορισμός.σε έναν ορισμένο αριθμό κυττάρων, το mRNA του γονιδίου Χ

Πόσα αντίτυπα υπάρχουν, αυτή είναι η απόλυτη ποσοτικοποίηση.Συνήθως αυτό που χρησιμοποιούμε περισσότερο στο εργαστήριο είναι η σχετική ποσοτική μέθοδος.Συνήθως,η μέθοδος 2-ΔΔctχρησιμοποιείται περισσότερο σε πειράματα, επομένως μόνο αυτή η μέθοδος θα εισαχθεί λεπτομερώς εδώ.

Μέθοδος 2-ΔΔct: Το αποτέλεσμα που προκύπτει είναι η διαφορά στην έκφραση του γονιδίου στόχου στην πειραματική ομάδα σε σχέση με το γονίδιο στόχο στην ομάδα ελέγχου.Απαιτείται οι αποτελεσματικότητες ενίσχυσης τόσο του γονιδίου στόχου όσο και του εσωτερικού γονιδίου αναφοράς να είναι κοντά στο 100%, και η σχετική απόκλιση δεν πρέπει να υπερβαίνει το 5%.

Η μέθοδος υπολογισμού έχει ως εξής:

Δct ομάδα ελέγχου = τιμή ct του γονιδίου στόχου στην ομάδα ελέγχου – τιμή ct του εσωτερικού γονιδίου αναφοράς στην ομάδα ελέγχου

Δct πειραματική ομάδα = τιμή ct του γονιδίου στόχου στην πειραματική ομάδα – τιμή ct του εσωτερικού γονιδίου αναφοράς στην πειραματική ομάδα

ΔΔct=Δct πειραματική ομάδα-Δct ομάδα ελέγχου

Τέλος, υπολογίστε το πολλαπλάσιο της διαφοράς στο επίπεδο έκφρασης:

Αλλαγή Fold=2-ΔΔct (που αντιστοιχεί στη συνάρτηση excel είναι POWER)

Σχετικά προϊόντα:

Κιτ Cell Direct RT-qPCR