Πρόσφατα, ανακάλυψα κάτι εκπληκτικό!Πολλοί προχωρημένοι επαγγελματίες του πειράματος γύρω του δεν γνωρίζουν καν κάποια πολύ βασικά σημεία πειραματικής γνώσης.

Για παράδειγμα, μπορείτε να απαντήσετε στις παρακάτω ερωτήσεις;

Υπάρχει διαφορά μεταξύ OD260 και A260;Τι σημαίνει το καθένα;
Το OD είναι η συντομογραφία της οπτικής πυκνότητας (οπτική πυκνότητα), το A είναι η συντομογραφία της απορρόφησης (απορρόφηση), οι δύο έννοιες είναι στην πραγματικότητα ίδιες, η "οπτική πυκνότητα" είναι "απορρόφηση", αλλά η "οπτική πυκνότητα" είναι σύμφωνη με τα περισσότερα εθνικά πρότυπα και πιο τυποποιημένη.

Συνήθως μετράμε την τιμή OD στα 260 nm για να υπολογίσουμε τη συγκέντρωση νουκλεϊκού οξέος, οπότε τι αντιπροσωπεύει το 1OD;
Το νουκλεϊκό οξύ έχει μέγιστη κορυφή απορρόφησης σε μήκος κύματος 260 nm, το οποίο περιέχει τόσο DNA όσο και RNA, καθώς και θραύσματα νουκλεϊκού οξέος (αυτό είναι το βασικό σημείο).
Η τιμή OD που μετρήθηκε σε μήκος κύματος 260 nm καταγράφηκε ως OD260.Εάν το δείγμα είναι καθαρό, η τιμή OD260 μπορεί να υπολογίσει τη συγκέντρωση του δείγματος νουκλεϊκού οξέος.
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (δίκλωνο DNA)
=37 μg/ml ssDNA (μονόκλωνο DNA)
=40 μg/ml RNA
=30 μg/ml dNTPs (ολιγονουκλεοτίδια)
Υπάρχει κάποια σύνδεση και διαφορά μεταξύ RT-PCR, Realtime-PCR και QPCR;
Το RT-PCR είναι συντομογραφία του Reverse Transcription PCR
Real Time PCR=qPCR, συντομογραφία του Quantitative Real Time PCR
Παρόλο που η PCR πραγματικού χρόνου (φθορισμού ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο) και η PCR αντίστροφης μεταγραφής (PCR αντίστροφης μεταγραφής) φαίνεται να συντομεύονται ως RT-PCR.Αλλά η διεθνής σύμβαση είναι: Η RT-PCR αναφέρεται συγκεκριμένα στην PCR αντίστροφης μεταγραφής.

Ποια είναι τα nt, bp και kb που χρησιμοποιούνται συνήθως για να περιγράψουν το μήκος του DNA/RNA στη βιολογία;
nt = νουκλεοτίδιο
bp = ζεύγος βάσεων ζεύγος βάσεων
kb = κιλοβάση

Φυσικά, θα έλεγες ότι πολλοί άνθρωποι αδιαφορούν για αυτές τις μικρές λεπτομέρειες!Όλοι το κάνουν αυτό και κανείς δεν θα σας ρωτήσει τι είναι.Ξέρεις ότι αυτό είναι περιττό, σωστά;

Όχι, όχι, όχι, είναι πολύ απαραίτητο να το γνωρίζουμε αυτό!γιατί;
Επειδή θέλετε να δημοσιεύσετε ένα άρθρο!Αδελφός!Είτε στοχεύετε στην αποφοίτηση είτε επιδιώκετε επιτεύγματα επιστημονικής έρευνας, πρέπει να βασιστείτε σε άρθρα για να μιλήσετε!

Η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος πρέπει να είναι το πιο απλό και βασικό πείραμα.Η ποιότητα της εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος καθορίζει άμεσα τα αποτελέσματα των επόμενων πειραμάτων.

Αν και το έχω πει πολλές φορές, υπάρχουν ακόμα πολλοί φίλοι που δεν τους νοιάζει.Αυτή τη φορά αποφάσισα να απομακρυνθώ από το άρθρο!

Ελάχιστες πληροφορίες για τη δημοσίευση ποσοτικών πειραμάτων PCR σε πραγματικό χρόνο, που αναφέρονται ως MIQE, είναι ένα σύνολο οδηγιών ποσοτικών πειραμάτων φθορισμού που κυκλοφόρησαν διεθνώς, το οποίο προτείνει ελάχιστα πρότυπα για τις πειραματικές πληροφορίες που είναι απαραίτητες για την αξιολόγηση των πειραμάτων ποσοτικής PCR φθορισμού και τη δημοσίευση άρθρων.Μέσω των πειραματικών συνθηκών και των μεθόδων ανάλυσης που παρέχονται από τον πειραματιστή, οι αξιολογητές μπορούν να αξιολογήσουν καλύτερα την εγκυρότητα του πειραματικού σχήματος του ερευνητή.

Μπορεί να φανεί ότι στην ενότητα της εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος, έχουν προταθεί τα ακόλουθα στοιχεία ανίχνευσης:

Το "E" υποδεικνύει πληροφορίες που πρέπει να παρέχονται και το "D" υποδεικνύει πληροφορίες που πρέπει να παρέχονται εάν είναι απαραίτητο.

Η φόρμα είναι πολύ περίπλοκη, στην πραγματικότητα, θέλω να πω ότι όλοι πρέπει να ξεκινήσουν από

καθαρότητα (D), απόδοση (D), ακεραιότητα (Ε) και συνοχή (Ε) για την αξιολόγηση των νουκλεϊκών οξέων σε αυτές τις τέσσερις απόψεις.

Σύμφωνα με πειραματικές συνήθειες, μιλήστε πρώτα για τις μεθόδους αξιολόγησης της καθαρότητας και της συγκέντρωσης.

Η μέτρηση OD είναι η αγαπημένη και πιο εύκολη μέθοδος ανίχνευσης για τους πειραματιστές.Όσον αφορά την αρχή, δεν θα μπω σε λεπτομέρειες εδώ.Πολλά εργαστήρια χρησιμοποιούν πλέον υπερμικροφασματοφωτόμετρα για την άμεση ποσοτική ανάλυση δειγμάτων νουκλεϊκών οξέων.Κατά την εμφάνιση της τιμής απορρόφησης, το πρόγραμμα δίνει απευθείας την τιμή συγκέντρωσης (νουκλεϊκό οξύ, πρωτεΐνη και φθορίζουσα βαφή) και τις σχετικές αναλογίες.Όσο για την ανάλυση της τιμής OD, αποθηκεύστε αυτήν την εικόνα και θα είστε εντάξει.

Λίστα λύσεων καθολικής τιμής OD

Ωστόσο, υπάρχουν μερικές επιφυλάξεις που πρέπει να γνωστοποιηθούν ξεχωριστά για εσάς.

(Τελικά, ξέρω ότι πρέπει να είστε αυτοί που αποταμιεύουν και να περιμένετε μέχρι να τους χρειαστείτε!)

Σημείωση 1 Εξοπλισμός

Η τιμή OD θα επηρεαστεί από διαφορετικό εξοπλισμό.Εφόσον το OD260 βρίσκεται εντός ενός συγκεκριμένου εύρους, οι τιμές των OD230 και OD280 έχουν νόημα.Για παράδειγμα, το εύρος απορρόφησης του κοινού Eppendorf D30 στα 260nm είναι 0~3A και του NanoDrop One του Thermo είναι στα 260nm.Το εύρος απορρόφησης 0,5~62,5A.

Σημείωση 2Αντιδραστήριο αραίωσης

Η τιμή OD μπορεί να επηρεαστεί από την αραίωση διαφορετικών αντιδραστηρίων.Για παράδειγμα, η ανάγνωση OD260/280 του καθαρισμένου RNA σε pH7,5 10mM Τριςbuffer είναι μεταξύ 1,9-2,1, ενώ σεουδέτερο υδατικό διάλυμαη αναλογία θα είναι χαμηλότερη, ίσως μόνο 1,8-2,0, αλλά αυτό δεν σημαίνει ότι η ποιότητα του RNA αλλάζει Διαφορά.

Σημείωση 3Υπολειμματικές ουσίες

Η ύπαρξη υπολειμματικών ουσιών θα επηρεάσει την ακρίβεια της μέτρησης της συγκέντρωσης νουκλεϊκού οξέος, επομένως είναι απαραίτητο να αποφεύγονται όσο το δυνατόν περισσότερο τα υπολείμματα πρωτεΐνης, φαινόλης, πολυσακχαρίτη και πολυφαινόλης σε δείγματα νουκλεϊκών οξέων.

Ωστόσο, στην πραγματικότητα, η εκχύλιση με οργανικά αντιδραστήρια είναι μια παλιά μέθοδος.Στα εμπορικά κιτ, το αποτέλεσμα εκχύλισης μπορεί να επιτευχθεί μέσω στήλης προσρόφησης με βάση το πυρίτιο σε συνδυασμό με φυγοκέντρηση, αποφεύγοντας τοξικά και επιβλαβή οργανικά αντιδραστήρια που είναι δύσκολο να αφαιρεθούν κ.λπ. Το πρόβλημα, όπως π.χ.Το κιτ εξαγωγής νουκλεϊκού οξέος της Foregene, δεν χρησιμοποιεί DNase/RNase και τοξικά οργανικά αντιδραστήρια καθ' όλη τη διάρκεια της λειτουργίας, γρήγορα και ασφαλή, και τοαποτέλεσμα είναιΚαλός(κατά λάθος είπε ότι ήταν φαλακρός, αλλά ξέρω ότι θέλετε να μάθετε).

Παράδειγμα 1: Απόδοση και καθαρότητα εκχύλισης γονιδιωματικού DNA

Το Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) επεξεργάζεται δείγματα εδάφους από διάφορες πηγές και η ποσότητα και η καθαρότητα του γονιδιωματικού DNA που λαμβάνεται παρουσιάζονται στον ακόλουθο πίνακα:
Παράδειγμα 2: Απόδοση και καθαρότητα εκχύλισης ιστού RNA

Το Animal Total RNA Isolation Kit (RE-03012) επεξεργάστηκε διάφορα δείγματα ιστού και η ποσότητα και η καθαρότητα του RNA που ελήφθη παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα (για ιστό ποντικού):
Ωστόσο, μην νομίζετε ότι έχετε τελειώσει με την τιμή OD.Έχετε κάποια φροντίδα για τα βασικά σημεία που σας σχεδίασα στο μπροστινό μέρος;

Ειδοποίηση

Τα τεμαχισμένα μόρια νουκλεϊκού οξέος θα υπολογιστούν επίσης στην απορρόφηση.Υποθέτοντας ότι έχετε υπολείμματα γονιδιωματικού DNA στο RNA, η τιμή OD σας θα φαίνεται να είναι πολύ υψηλή, αλλά η πραγματική συγκέντρωση του RNA δεν μπορεί να προσδιοριστεί.Εάν το RNA σας είναι Δεν είναι σαφές εάν υπάρχει αποικοδόμηση, επομένως χρειαζόμαστε μια ολοκληρωμένη μέθοδο αξιολόγησης για να δώσουμε μια πιο ακριβή κρίση, δηλαδή την αξιολόγηση ακεραιότητας νουκλεϊκού οξέος που αναφέρεται στο MIQE.