Συμβουλές για τη βελτίωση της ανάκτησης κόλλας

1. Αυξήστε το φορτίο δείγματος κατά την ηλεκτροφόρηση.

2. Χρησιμοποιήστε πρόσφατα παρασκευασμένο ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης.

3. Όταν κόβετε κόλλα, προσπαθήστε να κόψετε μόνο την κόλλα με λωρίδες για να μειώσετε τον όγκο κοπής της κόλλας: δεν χρειάζεστε κόλλα με λίγα θραύσματα χρήσεως, διαφορετικά θα επηρεάσει το ποσοστό ανάκτησης.

4. Αφού λιώσετε δύο ή περισσότερα κομμάτια κόλλας, χρησιμοποιήστε ένα σωλήνα όσο μεγάλος κι αν είναι ο όγκος και μεταφέρετέ τον στην ίδια στήλη.

5. Το διάλυμα που προστίθεται στο κολλοειδές διάλυμα μπορεί να είναι λίγο περισσότερο, το οποίο ευνοεί περισσότερο τη σύνδεση του DNA με τη μεμβράνη, αλλά γενικά δεν υπερβαίνει τα 750 ul.

6. Το κλειδί για την ανάκτηση γέλης είναι η σύνδεση του DNA στη στήλη μέσω της συγκέντρωσης άλατος, της οξύτητας (φόρτισης) και της υδροφοβικότητας του διαλύματος στη στήλη.Επομένως, εάν το pH του ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης είναι πολύ υψηλό, 10 ul (pH 5,0, 3 mol/L NaAC) μπορούν να προστεθούν στο διάλυμα.Προκειμένου να αναχαιτιστούν καλύτερα τα μόρια DNA στη μεμβράνη, μπορεί να προστεθεί 30% ισοπροπανόλη για να θερμανθεί στο υγρό μετά τη διάλυση της κόλλας.

7. Πριν προσθέσετε το υγρό έκλουσης, αφήστε τη στήλη σε θερμοκρασία δωματίου για λίγα λεπτά (περίπου 10 λεπτά) για να εξατμιστεί πλήρως η αιθανόλη.

8. Τέλος, προσθέστε λιγότερο υγρό έκλουσης για να ελαχιστοποιήσετε τον όγκο ανάκτησης.Γενικά, χρησιμοποιούνται 30-50μl υγρό έκλουσης (όχι πολύ λίγο, διαφορετικά δεν θα μπορεί να διαβρέξει τη μεμβράνη, κάτι που δεν ευνοεί την έκλουση).τα σταγονίδια έκλουσης βρίσκονται στο κέντρο της μεμβράνης, για να εκλουστεί πλήρως το DNA που είναι δεσμευμένο στη μεμβράνη.

9. Μετά την προσθήκη του υγρού έκλουσης, μπορεί να εκλουσθεί σε υδατόλουτρο 55 μοιρών για 5 λεπτά ή να τοποθετηθεί σε λουτρό νερού 50 μοιρών για περισσότερο από 10 λεπτά ή να σφραγιστεί με ένα παραφίλμ στους 4 βαθμούς κατά τη διάρκεια της νύχτας και στη συνέχεια να φυγοκεντρηθεί για ανάκτηση την επόμενη μέρα, το αποτέλεσμα είναι καλό.

10. Προσθέστε το φυγοκεντρημένο έκλουσμα πίσω στη στήλη προσρόφησης και φυγοκεντρήστε ξανά.

Λεπτομερείς μέθοδοι και διαδικασίες για την ανάκτηση προϊόντος PCR

1. Συνηθισμένη ανακύκλωση καουτσούκ

Εάν θέλετε να ανακτήσετε την κόλλα, είναι καλύτερο να χρησιμοποιήσετε ένα κιτ, το οποίο είναι βολικό και έχει ελαφρώς υψηλότερο ποσοστό ανάκτησης.Εάν πραγματικά χρειάζεται να το ανακτήσετε χειροκίνητα, μπορείτε να προσθέσετε 3 φορές τον όγκο TE μετά την κοπή της κόλλας.Μετά την τήξη σε υδατόλουτρο, η φαινόλη, η φαινόλη/χλωροφόρμιο εκχυλίζονται καθαρά και η αιθανόλη κατακρημνίζεται.Αυτό είναι.

2. Ανάκτηση DNA από πηκτώματα χαμηλού σημείου τήξης

Καθαρισμός θραυσμάτων DNA Προσθέστε ΤΕ (10 mmol/l Tris-HCl pH8,0, 0,1 mmol/l EDTA) ίσο με τον όγκο της γέλης και τοποθετήστε σε υδατόλουτρο 65°C για 5 λεπτά για να διαλυθεί πλήρως η γέλη.

Αφού φέρθηκε σε θερμοκρασία δωματίου, προστέθηκε ίση ποσότητα φαινόλης (κεκορεσμένη με ΤΕ, ΤΕ σφραγίστηκε στην ανώτερη στιβάδα και η κάτω στιβάδα φαινόλης αφαιρέθηκε) και το μίγμα αναμίχθηκε απαλά (δεν απαιτείται ανάμειξη) και φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 rpm για 3 λεπτά.Επαναλάβετε 1-2 φορές.

Πάρτε το υπερκείμενο, προσθέστε 0,1 όγκο 3 mol/L οξικού νατρίου (ρΗ 5,2) και 2,5 φορές τον όγκο απόλυτης αιθανόλης για να πραγματοποιηθεί η καθίζηση με αιθανόλη.Διαλύστε το καθαρισμένο DNA με κατάλληλη ποσότητα ΤΕ, μετρήστε το περιεχόμενο και προετοιμάστε για χρήση (μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ανάλυση δομής γονιδίου στόχου, προετοιμασία ανιχνευτή κ.λπ.).

3. Ανάκτηση PCR με καλή ειδικότητα ενίσχυσης

Εάν η ειδικότητα της ενίσχυσης PCR είναι καλή, είναι απλώς ένας απλός καθαρισμός και ανάκτηση του προϊόντος PCR.Μπορείτε να προσθέσετε 50 μg/ml πρωτεϊνάση Κ στο προϊόν PCR, 37 βαθμούς για 1 ώρα, να εκχυλίσετε μία φορά με φαινόλη/χλωροφόρμιο, να εκχυλίσετε μία φορά με χλωροφόρμιο και να προσθέσετε 0,1 όγκο του υπερκειμένου.Το οξικό νάτριο ανακτήθηκε με καθίζηση με 2,5 όγκους απόλυτης αιθανόλης.

Σχετικά προϊόντα:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/