Οι παραδοσιακές αντίστροφες μεταγραφάσες δεν μπορούν να ανεχθούν υψηλές θερμοκρασίες (η βέλτιστη θερμοκρασία για τη δραστηριότητα του MMLV είναι 37-50°C και η AMV είναι 42-60°C).Το πιο πολύπλοκο ιικό RNA δεν μπορεί να μεταγραφεί αποτελεσματικά σε cDNA σε χαμηλές θερμοκρασίες, με αποτέλεσμα την αποτελεσματικότητα ανίχνευσης Η μείωση.Η παραδοσιακή RT-qPCR γενικά απαιτεί τη συμμετοχή δύο βασικών ενζύμων (αντίστροφης μεταγραφάσης και DNA πολυμεράσης), γεγονός που καθιστά αδύνατη την απλοποίηση της λειτουργίας του συστήματος αντίδρασης και τη μείωση του κόστους.Εδώ θα παρουσιάσουμε δύο αντίστροφες μεταγραφάσες ανθεκτικές σε υψηλές θερμοκρασίες, την TtH και την RevTaq.Αυτά τα δύο ένζυμα έχουν επίσης τη λειτουργία της πολυμεράσης του DNA, επομένως ονομάζονται διλειτουργικά ένζυμα.

TtH DNA πολυμεράση

Πρέπει να έχετε ακούσει για το TtH, το οποίο προέρχεται από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus thermophilus HB8.Παρουσία δισθενών κατιόντων όπως το Mg2+, έχει δράση πολυμεράσης DNA.Χρησιμοποιείται ευρέως σε αντιδράσεις PCR όπως το ένζυμο Taq, αλλά έχει υψηλότερη αντίσταση στη θερμότητα από το ένζυμο Taq, επομένως έχει επίσης καλύτερη επίδραση στην PCR με πρότυπα υψηλής περιεκτικότητας σε GC.

· Αυτό το ένζυμο βασικά δεν έχει δραστηριότητα εξωνουκλεάσης 3'→5' και δραστηριότητα εξωνουκλεάσης 5'→3', επομένως μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για διδεοξυ αλληλουχία.

· Αυτό το ένζυμο έχει δράση RTase.Παρουσία Mn2+, η δραστηριότητα RTase θα ενισχυθεί.Χρησιμοποιώντας αυτό το χαρακτηριστικό, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτέλεση αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής και αντίδρασης PCR στον ίδιο σωλήνα, δηλαδή RT-PCR ενός σταδίου.Ωστόσο, παρουσία Mn2+, η ακρίβεια της RT-PCR δεν είναι υψηλή.Η δραστηριότητα RT δεν έχει καμία σχέση με τη δραστηριότητα της rnaase H.

· Η αυξημένη δραστηριότητα της πολυμεράσης Tth-DNA (pH9, βέλτιστο +55℃~70℃, μέγιστο +95℃) ξεπερνά τα προβλήματα που προκαλούνται από τη δευτερογενή δομή του RNA.Το cDNA που προκύπτει μπορεί να ενισχυθεί με PCR με το ίδιο ένζυμο παρουσία ιόντων Mg2+.

· Η ικανότητα της πολυμεράσης Tth-DNA να εκτελεί αντίστροφη μεταγραφή και ενίσχυση DNA σε υψηλές θερμοκρασίες καθιστά αυτό το ένζυμο χρήσιμο για ποσοτική RT-PCR, κλωνοποίηση και ανάλυση γονιδιακής έκφρασης κυτταρικού και ιικού RNA.
· Η πολυμεράση Tth-DNA χρησιμοποιείται για RT-PCR για ενίσχυση RNA έως 1 kb.

Χαρακτηριστικά και πλεονεκτήματα

Tth DNA πολυμεράση:

• Βεβαιωθείτε ότι το μέγεθος του προϊόντος βελτιστοποιημένης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), τουλάχιστον 1000 bp στην αντίδραση RT-PCR

• Αποδεχτείτε τον τροποποιημένο τριφωσφορικό δεοξυριβονουκλεοζίτη ως υπόστρωμα

• Δεν σχετίζεται με τη δραστηριότητα RNase H

• Έχει υψηλή θερμική σταθερότητα για την αντιμετώπιση προβλημάτων, που συνήθως σχετίζονται με την υψηλή δευτερογενή δομή που υπάρχει στο RNA

RevTaq RT-PCR DNA πολυμεράση

Μια ανθεκτική στη θερμότητα πολυμεράση DNA με δράση ανάστροφης μεταγραφάσης

Η πολυμεράση RevTaq-RT-PCR-DNA είναι ένα κατασκευασμένο, εξαιρετικά ανθεκτικό στη θερμότητα, διπλής λειτουργίας ένζυμο με δραστηριότητες ανάστροφης μεταγραφάσης και DNA πολυμεράσης που λαμβάνονται μέσω κατευθυνόμενης και τεχνητής εξέλιξης.

· Ο χρόνος ημιζωής της πολυμεράσης DNA RevTaq RT-PCR στους 95°C είναι μεγαλύτερος από 40 λεπτά.

· Η πολυμεράση DNA της RevTaq RT-PCR επιτρέπει την αντίστροφη μεταγραφή σε υψηλή θερμοκρασία απευθείας από το πρότυπο RNA και το βήμα της αντίστροφης μεταγραφής μπορεί να επαναληφθεί πολλές φορές για να δημιουργηθούν περισσότερα πρότυπα cDNA.

· Η πολυμεράση DNA της RevTaq RT-PCR επιτρέπει την RT-PCR «μηδενικού σταδίου» (χωρίς ισοθερμικό στάδιο αντίστροφης μεταγραφής), επειδή στο στάδιο επέκτασης της κυκλικής PCR, η αντίστροφη μεταγραφή και η ενίσχυση DNA συμβαίνουν ταυτόχρονα.Αυτό προάγει επίσης την αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής σε υψηλές θερμοκρασίες, ελαχιστοποιώντας έτσι τα προβλήματα που συναντώνται κατά την τήξη της ισχυρής δευτερογενούς δομής στο RNA σε υψηλές θερμοκρασίες.

· Λόγω της φόρμουλας θερμής εκκίνησης με βάση το απταμερές, η πολυμεράση DNA RevTaq RT-PCR θα παράγει καλύτερα αποτελέσματα όταν η θερμοκρασία ανόπτησης και επέκτασης είναι υψηλότερη από 57°C.

· Δεδομένου ότι το ένζυμο είναι ανθεκτικό στη θερμότητα, συνιστάται ο σχεδιασμός εκκινητών και ανιχνευτών με πολύ υψηλά σημεία τήξης (>60°C).

· Συνιστάται η βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας του βήματος ανόπτησης/επέκτασης μέσω μιας βαθμίδας θερμοκρασίας κατά τη διαδικασία ρύθμισης της αντίδρασης.

· Όσο υψηλότερη είναι η θερμοκρασία, τόσο μεγαλύτερη είναι η ειδικότητα της PCR.Ο κύκλος αντίστροφης μεταγραφής εκτελείται συνήθως σε υψηλότερη θερμοκρασία από τον κύκλο PCR, επειδή ο υβριδισμός εκκινητής DNA: RNA Template συνήθως έχει υψηλότερο σημείο τήξης από το DNA Primer:cDNA Template duplex.

· Η πολυμεράση DNA RevTaq RT-PCR είναι γενετικά τροποποιημένη και βελτιστοποιημένη και το μέγεθος του αμπλικονίου είναι μεταξύ 60-300 bp.

Το όριο ανίχνευσης πολυμεράσης DNA του RevTaq RT-PCR φτάνει τα 4 αντίγραφα/

Το βελτιστοποιημένο σύστημα αντίδρασης (η εγκατάσταση εκκινητών υψηλού σημείου τήξης) φαίνεται στο σχήμα.Η RT-PCR που βασίζεται σε πολυμεράση DNA του RevTaq RT-PCR δείχνει καλύτερη ευαισθησία από το κύριο μείγμα RT-qPCR 1 σταδίου TaqPath και χαμηλότερη κλίση αραίωσης δείγματος ανίχνευσης.

Περισσότερα πλεονεκτήματα:

Λειτουργία γρήγορης εκκίνησης → Το αρχικό βήμα θερμικής μετουσίωσης μπορεί να παραλειφθεί.

Τύπος απταμερούς θερμής εκκίνησης → Παρέχετε 100% ενζυμική δραστηριότητα αμέσως και αποτρέψτε τη μη ειδική ενίσχυση σε χαμηλές θερμοκρασίες (<57°C).

Λειτουργία διάσπασης → Το βήμα εκχύλισης RNA παραλείπεται, επειδή η πολυμεράση DNA RevTaq RT-PCR μπορεί επίσης να επεξεργαστεί ακατέργαστα δείγματα αντίδρασης.Μπορεί να καταστρέψει αμέσως τις κυτταρικές μεμβράνες των ευκαρυωτών, των βακτηρίων και των ιών σε έναν θερμό κύκλο RT-PCR.

Επίπεδο πρώτης ύλης IVD → υψηλά πρότυπα ποιότητας και εξαιρετικά ανταγωνιστικές τιμές