• Η PCR είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για την ενίσχυση του DNA από μια μικρή ποσότητα μήτρας DNA.Η RT-PCR χρησιμοποιεί αντίστροφη μεταγραφή για να παράγει ένα πρότυπο DNA από μια πηγή RNA που μπορεί στη συνέχεια να ενισχυθεί.
• Η PCR και η RT-PCR είναι τυπικά αντιδράσεις τελικού σημείου, ενώ οι qPCR και RT-qPCR χρησιμοποιούν την κινητική του ρυθμού σύνθεσης του προϊόντος κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR για να ποσοτικοποιήσουν την ποσότητα του εκμαγείου που υπάρχει.
• Νεότερες μέθοδοι, όπως η ψηφιακή PCR, παρέχουν απόλυτη ποσοτικοποίηση του αρχικού προτύπου DNA, ενώ μέθοδοι όπως η ισοθερμική PCR μειώνουν την ανάγκη για ακριβό εξοπλισμό για την παροχή αξιόπιστων αποτελεσμάτων.

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια σχετικά απλή και ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική μοριακής βιολογίας για την ενίσχυση και την ανίχνευση αλληλουχιών DNA και RNA.Σε σύγκριση με τις παραδοσιακές μεθόδους κλωνοποίησης και ενίσχυσης DNA, που συχνά μπορεί να διαρκέσουν μέρες, η PCR απαιτεί μόνο λίγες ώρες.Η PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και απαιτεί ελάχιστο πρότυπο για την ανίχνευση και την ενίσχυση συγκεκριμένων αλληλουχιών.Οι βασικές μέθοδοι PCR έχουν προχωρήσει περαιτέρω από την απλή ανίχνευση DNA και RNA.Παρακάτω, παρέχουμε μια επισκόπηση των διαφορετικών μεθόδων PCR και των αντιδραστηρίων που παρέχουμε στην Enzo Life Sciences για τις ερευνητικές σας ανάγκες.Στόχος μας είναι να βοηθήσουμε τους επιστήμονες να έχουν γρήγορη πρόσβαση σε αντιδραστήρια PCR για χρήση στο επόμενο ερευνητικό τους έργο!

PCR

Για την τυπική PCR, το μόνο που χρειάζεστε είναι μια πολυμεράση DNA, μαγνήσιο, νουκλεοτίδια, εκκινητές, το εκμαγείο DNA που πρόκειται να ενισχυθεί και ένας θερμοκυκλοποιητής.Ο μηχανισμός PCR είναι τόσο απλός όσο και ο σκοπός του: 1) το δίκλωνο DNA (dsDNA) είναι θερμικά μετουσιωμένο, 2) οι εκκινητές ευθυγραμμίζονται με τους απλούς κλώνους του DNA και 3) οι εκκινητές επεκτείνονται με DNA πολυμεράση, με αποτέλεσμα δύο αντίγραφα του αρχικό κλώνο DNA.Η διαδικασία μετουσίωσης, ανόπτησης και επιμήκυνσης σε μια σειρά θερμοκρασιών και χρόνων είναι γνωστή ως ένας κύκλος ενίσχυσης (Εικ. 1).

Κάθε βήμα του κύκλου θα πρέπει να βελτιστοποιηθεί για το πρότυπο και το σετ εκκινητών που χρησιμοποιείται.Αυτός ο κύκλος επαναλαμβάνεται περίπου 20-40 φορές και το ενισχυμένο προϊόν μπορεί στη συνέχεια να αναλυθεί, τυπικά με γέλη αγαρόζης (Εικ. 2).

Καθώς η PCR είναι μια εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος και απαιτούνται πολύ μικροί όγκοι για μεμονωμένες αντιδράσεις, συνιστάται η παρασκευή ενός κύριου μείγματος για πολλές αντιδράσεις.Το κύριο μείγμα πρέπει να αναμιχθεί καλά και στη συνέχεια να χωριστεί με τον αριθμό των αντιδράσεων, διασφαλίζοντας ότι κάθε αντίδραση θα περιέχει την ίδια ποσότητα ενζύμου, dNTPs και εκκινητών.Πολλοί προμηθευτές, όπως η Enzo Life Sciences, προσφέρουν επίσης μείγματα PCR που περιέχουν ήδη τα πάντα εκτός από εκκινητές και το πρότυπο DNA.

Περιοχές πλούσιες σε γουανίνη/κυτοσίνη (πλούσιες σε GC) αντιπροσωπεύουν μια πρόκληση στις τυπικές τεχνικές PCR.Οι πλούσιες σε GC αλληλουχίες είναι πιο σταθερές από τις αλληλουχίες με χαμηλότερη περιεκτικότητα σε GC.Επιπλέον, οι πλούσιες σε GC αλληλουχίες τείνουν να σχηματίζουν δευτερεύουσες δομές, όπως βρόχους φουρκέτας.Ως αποτέλεσμα, οι διπλοί κλώνοι πλούσιοι σε GC είναι δύσκολο να διαχωριστούν πλήρως κατά τη φάση της μετουσίωσης.Κατά συνέπεια, η DNA πολυμεράση δεν μπορεί να συνθέσει τον νέο κλώνο χωρίς εμπόδια.Μια υψηλότερη θερμοκρασία μετουσίωσης μπορεί να το βελτιώσει και οι προσαρμογές προς υψηλότερη θερμοκρασία ανόπτησης και μικρότερο χρόνο ανόπτησης μπορούν να αποτρέψουν την ασυνήθιστη σύνδεση των πλούσιων σε GC εκκινητών.Πρόσθετα αντιδραστήρια μπορούν να ενισχύσουν την ενίσχυση αλληλουχιών πλούσιων σε GC.Το DMSO, η γλυκερόλη και η βεταΐνη βοηθούν στη διάσπαση των δευτερογενών δομών που προκαλούνται από αλληλεπιδράσεις GC και έτσι διευκολύνουν τον διαχωρισμό των διπλών κλώνων.

Hot Start PCR

Η μη ειδική ενίσχυση είναι ένα πρόβλημα που μπορεί να παρουσιαστεί κατά τη διάρκεια της PCR.Οι περισσότερες πολυμεράσες DNA που χρησιμοποιούνται για PCR λειτουργούν καλύτερα σε θερμοκρασίες περίπου 68°C έως 72°C.Το ένζυμο μπορεί, ωστόσο, να είναι επίσης ενεργό σε χαμηλότερες θερμοκρασίες, αν και σε χαμηλότερο βαθμό.Σε θερμοκρασίες πολύ χαμηλότερες από τη θερμοκρασία ανόπτησης, οι εκκινητές μπορούν να δεσμευτούν μη ειδικά και να οδηγήσουν σε μη ειδική ενίσχυση, ακόμη και αν η αντίδραση έχει ρυθμιστεί σε πάγο.Αυτό μπορεί να αποφευχθεί με τη χρήση αναστολέων πολυμεράσης που διαχωρίζονται από την DNA πολυμεράση μόνο όταν επιτευχθεί μια συγκεκριμένη θερμοκρασία, εξ ου και ο όρος PCR θερμής εκκίνησης.Ο αναστολέας μπορεί να είναι ένα αντίσωμα που δεσμεύει την πολυμεράση και μετουσιώνεται στην αρχική θερμοκρασία μετουσίωσης (95°C τυπικά).

Πολυμεράση υψηλής πιστότητας

Ενώ οι πολυμεράσες DNA ενισχύονται με αρκετά μεγάλη ακρίβεια στην αρχική αλληλουχία μήτρας, μπορεί να συμβούν λάθη στην αντιστοίχιση νουκλεοτιδίων.Αναντιστοιχίες σε εφαρμογές όπως η κλωνοποίηση μπορεί να έχουν ως αποτέλεσμα περικομμένα μεταγραφήματα και λανθασμένες ή ανενεργές πρωτεΐνες κατάντη.Για να αποφευχθούν αυτές οι αναντιστοιχίες, πολυμεράσες με δραστηριότητα «διόρθωσης» έχουν εντοπιστεί και ενσωματωθεί στη ροή εργασίας.Η πρώτη πολυμεράση διόρθωσης, Pfu, αναγνωρίστηκε το 1991 στον Pyrococcus furiosus.Αυτό το ένζυμο Pfu έχει δράση εξωνουκλεάσης 3' έως 5'.Καθώς το DNA ενισχύεται, η εξωνουκλεάση αφαιρεί τα αταίριαστα νουκλεοτίδια στο 3' άκρο του κλώνου.Στη συνέχεια αντικαθίσταται το σωστό νουκλεοτίδιο και η σύνθεση DNA συνεχίζεται.Η ταυτοποίηση εσφαλμένων αλληλουχιών νουκλεοτιδίων βασίζεται στη συγγένεια δέσμευσης για το σωστό τριφωσφορικό νουκλεοσίδιο με το ένζυμο, όπου η ανεπαρκής δέσμευση επιβραδύνει τη σύνθεση και επιτρέπει τη σωστή αντικατάσταση.Η δραστηριότητα διόρθωσης της πολυμεράσης Pfu οδηγεί σε λιγότερα σφάλματα στην τελική αλληλουχία σε σύγκριση με την πολυμεράση DNA Taq.Τα τελευταία χρόνια, έχουν εντοπιστεί και άλλα ένζυμα διόρθωσης και έχουν γίνει τροποποιήσεις του αρχικού ενζύμου Pfu για περαιτέρω μείωση του ποσοστού σφάλματος κατά την ενίσχυση του DNA.

RT-PCR

Η PCR αντίστροφης μεταγραφής, ή RT-PCR, επιτρέπει τη χρήση του RNA ως πρότυπο.Ένα επιπλέον βήμα επιτρέπει την ανίχνευση και την ενίσχυση του RNA.Το RNA μεταγράφεται αντίστροφα σε συμπληρωματικό DNA (cDNA), χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση.Η ποιότητα και η καθαρότητα του εκμαγείου RNA είναι απαραίτητες για την επιτυχία της RT-PCR.Το πρώτο βήμα της RT-PCR είναι η σύνθεση ενός υβριδίου DNA/RNA.Η αντίστροφη μεταγραφάση έχει επίσης μια λειτουργία RNase H, η οποία αποικοδομεί το τμήμα RNA του υβριδίου.Το μονόκλωνο μόριο DNA συμπληρώνεται στη συνέχεια από την εξαρτώμενη από DNA δραστικότητα πολυμεράσης DNA της αντίστροφης μεταγραφάσης σε cDNA.Η αποτελεσματικότητα της αντίδρασης του πρώτου κλώνου μπορεί να επηρεάσει τη διαδικασία ενίσχυσης.Από εδώ και πέρα, η τυπική διαδικασία PCR χρησιμοποιείται για την ενίσχυση του cDNA.Η δυνατότητα επαναφοράς του RNA σε cDNA με RT-PCR έχει πολλά πλεονεκτήματα και χρησιμοποιείται κυρίως για ανάλυση γονιδιακής έκφρασης.Το RNA είναι μονόκλωνο και πολύ ασταθές, γεγονός που καθιστά δύσκολη την εργασία μαζί του.Συνήθως χρησιμεύει ως πρώτο βήμα στην qPCR, η οποία ποσοτικοποιεί τα μεταγραφήματα RNA σε ένα βιολογικό δείγμα.

qPCR και RT-qPCR

Η ποσοτική PCR (qPCR) χρησιμοποιείται για την ανίχνευση, τον χαρακτηρισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό νουκλεϊκών οξέων για πολλές εφαρμογές.Στην RT-qPCR, τα μεταγραφήματα RNA συχνά ποσοτικοποιούνται με αντίστροφη μεταγραφή τους σε cDNA πρώτα, όπως περιγράφεται παραπάνω, και στη συνέχεια πραγματοποιείται qPCR.Όπως και στην τυπική PCR, το DNA ενισχύεται με τρία επαναλαμβανόμενα στάδια: μετουσίωση, ανόπτηση και επιμήκυνση.Ωστόσο, στην qPCR, η σήμανση με φθορισμό επιτρέπει τη συλλογή δεδομένων καθώς προχωρά η PCR.Αυτή η τεχνική έχει πολλά πλεονεκτήματα λόγω του φάσματος των διαθέσιμων μεθόδων και χημικών.

Σε qPCR που βασίζεται σε βαφή (συνήθως πράσινη), η φθορίζουσα σήμανση επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό των ενισχυμένων μορίων DNA χρησιμοποιώντας τη χρήση μιας χρωστικής δέσμευσης dsDNA.Κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου, μετράται ο φθορισμός.Το σήμα φθορισμού αυξάνεται αναλογικά με την ποσότητα του αντιγραφόμενου DNA.Ως εκ τούτου, το DNA ποσοτικοποιείται σε «πραγματικό χρόνο» (Εικ. 3).Τα μειονεκτήματα στην qPCR με βάση τη βαφή είναι ότι μόνο ένας στόχος μπορεί να εξεταστεί τη φορά και ότι η χρωστική θα συνδεθεί με οποιοδήποτε ds-DNA υπάρχει στο δείγμα.

Στην qPCR που βασίζεται σε ανιχνευτή, πολλοί στόχοι μπορούν να ανιχνευθούν ταυτόχρονα σε κάθε δείγμα, αλλά αυτό απαιτεί βελτιστοποίηση και σχεδιασμό ειδικού για τον στόχο ανιχνευτή που χρησιμοποιείται επιπλέον των εκκινητών.Υπάρχουν διάφοροι τύποι σχεδίων ανιχνευτών, αλλά ο πιο συνηθισμένος τύπος είναι ένας ανιχνευτής υδρόλυσης, ο οποίος ενσωματώνει ένα φθοροφόρο και σβηστήρα.Η μεταφορά ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET) αποτρέπει την εκπομπή του φθοροφόρου μέσω του σβηστήρα ενώ ο ανιχνευτής είναι άθικτος.Ωστόσο, κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR, ο ανιχνευτής υδρολύεται κατά την επέκταση του εκκινητή και την ενίσχυση της ειδικής αλληλουχίας στην οποία είναι δεσμευμένος.Η διάσπαση του ανιχνευτή διαχωρίζει το φθοροφόρο από τον αποσβεστήρα και έχει ως αποτέλεσμα μια αύξηση του φθορισμού που εξαρτάται από την ενίσχυση (Εικ. 4).Έτσι, το σήμα φθορισμού από μια αντίδραση qPCR που βασίζεται σε ανιχνευτή είναι ανάλογο με την ποσότητα της αλληλουχίας στόχου ανιχνευτή που υπάρχει στο δείγμα.Επειδή η qPCR που βασίζεται σε ανιχνευτή είναι πιο συγκεκριμένη από την qPCR που βασίζεται σε βαφή, είναι συχνά η τεχνολογία που χρησιμοποιείται σε διαγνωστικές αναλύσεις που βασίζονται σε qPCR.

Ισοθερμική Ενίσχυση

Οι τεχνικές PCR που αναφέρονται παραπάνω απαιτεί ακριβό εξοπλισμό θερμοκυκλοποίησης για την ακριβή αύξηση και μείωση της θερμοκρασίας του θαλάμου για τα βήματα μετουσίωσης, ανόπτησης και επέκτασης.Έχει αναπτυχθεί μια σειρά από τεχνικές που δεν χρειάζονται τόσο ακριβείς συσκευές και μπορούν να εκτελεστούν σε ένα απλό λουτρό νερού ή ακόμα και μέσα στα κελιά που μας ενδιαφέρουν.Αυτές οι τεχνικές ονομάζονται συλλογικά ισοθερμική ενίσχυση και λειτουργούν με βάση την εκθετική, γραμμική ή καταρράκτη ενίσχυση.

Ο πιο γνωστός τύπος ισοθερμικής ενίσχυσης είναι η ισοθερμική ενίσχυση μέσω βρόχου ή LAMP.Το LAMP χρησιμοποιεί εκθετική ενίσχυση στους 65⁰C για να ενισχύσει το πρότυπο DNA ή RNA.Κατά την εκτέλεση LAMP, τέσσερις έως έξι εκκινητές συμπληρωματικοί σε περιοχές του DNA στόχου χρησιμοποιούνται με μια DNA πολυμεράση για τη σύνθεση νέου DNA.Δύο από αυτούς τους εκκινητές έχουν συμπληρωματικές αλληλουχίες που αναγνωρίζουν αλληλουχίες στους άλλους εκκινητές και τους δεσμεύουν, επιτρέποντας να σχηματιστεί μια δομή «βρόγχου» στο νεοσυντιθέμενο DNA που στη συνέχεια βοηθά στην ανόπτηση του εκκινητή σε επόμενους γύρους ενίσχυσης.Το LAMP μπορεί να οπτικοποιηθεί με πολλαπλές μεθόδους, όπως φθορισμό, ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης ή χρωματομετρία.Η ευκολία απεικόνισης και ανίχνευσης της παρουσίας ή απουσίας προϊόντος με χρωματομετρία και η έλλειψη ακριβού εξοπλισμού που απαιτείται κατέστησαν το LAMP κατάλληλη επιλογή για δοκιμές SARS-CoV-2 σε περιοχές όπου δεν ήταν άμεσα διαθέσιμες οι κλινικές εργαστηριακές δοκιμές ή αποθήκευση και μεταφορά δειγμάτων δεν ήταν εφικτό ή σε εργαστήρια που δεν είχαν προηγουμένως εξοπλισμό θερμοκυκλοποίησης PCR.