Η RNase είναι μια ευαίσθητη λέξη που πολλοί μαθητές που συχνά διεξάγουν πειράματα εξαγωγής RNA δεν θέλουν να ακούσουν.Πλήρως οπλισμένο, το RNA που τελικά εκχυλίστηκε με τα εξαιρετικά τοξικά αντιδραστήρια φαινόλη και χλωροφόρμιο αποικοδομήθηκε.Δεν είμαι συμφιλιωμένος!!!Σήμερα, ας ρίξουμε μια ματιά στην προέλευση του διάσημου Rnase.

Η ριβονουκλεάση (RNase), ή RNase, είναι μια νουκλεάση που μπορεί να υδρολύσει το RNA σε μικρά μόρια.Η RNase, ως πρωτεΐνη μικρού μορίου, είναι ασυνήθιστα σταθερή .Η συμβατική αποστείρωση με ατμό υψηλής θερμοκρασίας και υψηλής πίεσης και οι αναστολείς πρωτεΐνης δεν μπορούν να την απενεργοποιήσουν πλήρως.Η σταθερότητα της RNase προέρχεται κυρίως από τους δισουλφιδικούς δεσμούς στη δομή.Για παράδειγμα, η ευρέως χρησιμοποιούμενη RNase του παγκρέατος βοοειδών έχει μόνο 124 αμινοξέα, αλλά περιέχει 4 δισουλφιδικούς δεσμούς.Ο δεσμός θείου και ο δεσμός δισουλφιδίου προσδίδουν στη RNase εξαιρετική θερμική σταθερότητα.Επιπλέον, το rnase έχει σχετικά μικρό μοριακό βάρος και μπορεί να αποκαταστήσει γρήγορα την αρχική του διαμόρφωση σε πολλές περιπτώσεις.

Εκτός από εξαιρετικά σταθερό,Οι RNases είναι πανταχού παρούσες στο εργαστήριο .Η RNase είναι ένας βιολογικός αμυντικός μηχανισμός.Για ένα κύτταρο, το εξωγενές RNA είναι συχνά θανατηφόρο.Σε σύγκριση με το εξωγενές DNA, το εξωγενές RNA είναι συχνά πιο επικίνδυνο.Το RNA μεταγράφεται και μεταφράζεται ευτυχώς, έτσι σχεδόν όλοι οι οργανισμοί έχουν εξελίξει RNases για να αμυνθούν έναντι της εισβολής εξωγενούς RNA.Επομένως, τα βακτηριακά κύτταρα που καλλιεργούνται στο εργαστήριο και εσείς που εκχυλίζετε το RNA αποπνέετε το άρωμα της RNase.Τα υγρά του ανθρώπινου σώματος (σάλιο, δάκρυα κ.λπ.) περιέχουν μεγάλη ποσότητα RNase, οπότε μην κλαίτε όταν το RNA αποικοδομείται.Όσο περισσότερο κλαις, τόσο χειρότερη είναι η υποβάθμιση του RNA!!Η αδελφή Daiyu δεν είναι κατάλληλη για εξαγωγή RNA!

Επιπλέον, το ευαίσθητο δέρμα σας περιέχει επίσης πολλή RNase και οι δείκτες, οι πιπέτες, οι πόρτες του ψυγείου και οι χειρολαβές των θυρών που έχουν αγγίξει το δέρμα περιέχουν επίσης RNase.

Με τόση περιπέτεια, ας ρίξουμε μια ματιά στον τρόπο αντιμετώπισης των RNases.

Το πρώτο πράγμα που σκέφτονται όλοι όταν αφαιρούν το RNA είναιDEPC(πυροανθρακικό διαιθυλεστέρα).Το DEPC μετουσιώνει κυρίως την πρωτεΐνη συνδυάζοντας με τον δακτύλιο ιμιδαζόλης της ενεργού ομάδας RNase ιστιδίνης, αναστέλλοντας έτσι τη δραστηριότητα του ενζύμου.Το 0,1% DEPC μπορεί να έχει καλύτερο αποτέλεσμα αφαίρεσης στο Rnase, αλλά πρέπει να προσέξουμε ότι το DEPC είναι γνωστό καρκινογόνο, επομένως πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή κατά τη χρήση του.

Για το RNase, πρέπει να ξεκινήσουμε από δύο πτυχές,το πρώτο είναι η αναστολή της δραστηριότητας της ενδογενούς RNase

Τα συμβατικά αντιδραστήρια εκχύλισης RNA όπως η ισοθειοκυανική γουανιδίνη και το DTT που περιέχονται στο Trizol μπορούν να ανοίξουν τον δισουλφιδικό δεσμό της RNase, αλλά εξακολουθούν να υπάρχουν ορισμένες RNases, ειδικά σε δείγματα ιστών, οπότε προσέξτε τη χαμηλή θερμοκρασία.

1.Βυθίστε αμέσως το δείγμα ιστού σε υγρό άζωτο αφού το βγάλετε ή σε ένα εμπορικό διάλυμα συντήρησης RNA.

2.Μετά την εκχύλιση του RNA του δείγματος κυττάρων, προσθέστε το στο διάλυμα λύσης και λύστε το στο κουτί πάγου

3. Είναι καλύτερο να χρησιμοποιείτε υγρό άζωτο για άλεση όταν τα δείγματα ιστού ομογενοποιούνται.Όταν χρησιμοποιείτε ηλεκτρικό ομογενοποιητή χωρίς υγρό άζωτο, προσέξτε την πλήρη προψύξη του προσαρμογέα ομογενοποίησης.

Η δεύτερη είναι η εξωγενής DNase

1.Να είστε πλήρως οπλισμένοι, να φοράτε εργαστηριακό παλτό, να φοράτε μάσκα και να φοράτε οπωσδήποτε ένα ζευγάρι καινούργια γάντια (μην είστε τόσο φειδωλοί! Πρέπει να σημειωθεί ότι το Trizol είναι εξαιρετικά διαβρωτικό και είναι επίσης πολύ ισχυρό μέσω των γαντιών, οπότε μην στάζει στα χέρια σας).

2.Όλα τα χρησιμοποιημένα άκρα πιπέττας, σωλήνες EP, σωλήνες PCR και άλλος εξοπλισμός πρέπει να υποβάλλονται σε επεξεργασία απο-RNase.Μπορεί να εμποτιστεί σε 0,1% DEPC και στη συνέχεια να συμπιεστεί υπό υψηλή πίεση.Προσέξτε τη λειτουργία σε απαγωγέα καπνού.Οι ντόπιοι τύραννοι μπορούν να αγοράσουν απευθείας αναλώσιμα για την απομάκρυνση των ενζύμων.

Υ.Γ.: Να σας πω μια τεμπέλικη μέθοδο.Αν και η υψηλή θερμοκρασία και η υψηλή πίεση δεν μπορούν να αφαιρέσουν πλήρως την RNase, θα αφαιρέσει ένα μεγάλο μέρος της.2 φορές υψηλή θερμοκρασία και υψηλή πίεση έχει καλό αποτέλεσμα και η εξαγωγή του RNA έχει μικρό αποτέλεσμα.

3.Το αλκοόλ μπορεί να μετουσιώσει τις πρωτεΐνες,οπότε ο πίνακας εξαγωγής RNA μπορεί να σκουπιστεί με 75% αλκοόλ , και τα γάντια μπορούν επίσης να ψεκαστούν με οινόπνευμα.

4.Το τελικό διάλυμα διάλυσης RNA και ο σωλήνας φυγοκέντρησης θα πρέπει επίσης να υποβληθούν σε επεξεργασία απο-RNase.Το νερό DEPC είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο διάλυμα διάλυσης RNA.Ας μιλήσουμε για τη σωστή μέθοδο παρασκευής του νερού DEPC (θυμηθείτε να επανασυσκευάσετε το εμπορικό DEPC όταν το αγοράσετε)

Προσθέστε το DEPC σε υπερκαθαρό νερό στο 1:1000, ανακινήστε καλά, αφήστε το να σταθεί όλη τη νύχτα στους 37°C και αποστειρώστε στους 121°C υπό υψηλή θερμοκρασία και υψηλή πίεση για 15 λεπτά.Το νερό DEPC μπορεί να αποθηκευτεί στους -20°C σε κλάσματα του 1ml.

Τέλος, για να συνοψίσουμε: η χαμηλή θερμοκρασία είναι το κλειδί, τα αναλώσιμα χειρίζονται καλά, πλήρως οπλισμένα και λιγότερη συζήτηση!

Λοιπόν, αυτό είναι για τη σημερινή στρατηγική.Σας εύχομαι όλη τη συγκέντρωση και την καθαρότητα του RNA που αναφέρατε.Και τα δύο A260/A280 είναι 2.0!!!

Φυσικά, εάν χρησιμοποιείτε αΚιτ εξαγωγής RNA λειτουργίας σε θερμοκρασία δωματίου, ενδέχεται να μην αντιμετωπίσετε τα παραπάνω προβλήματα.

Λειτουργία σε θερμοκρασία δωματίου, χωρίς προσθήκη DNase, εξάγει ολικό RNA από κύτταρα σε 11 λεπτά και εξάγει συνολικό RNA από ζωικούς ιστούς ή φυτά σε 30 λεπτά.

Για δοκιμαστικά δείγματα, επικοινωνήστε με:overseas@foregene.com

Σχετικά προϊόντα:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/