Το RT-qPCR είναι το βασικό πείραμα της μοριακής βιολογίας και όλοι πρέπει να είναι εξοικειωμένοι με αυτό.Περιλαμβάνει κυρίως τρία στάδια: εξαγωγή RNA, αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA και φθορίζουσα ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο.Δεν βοηθάει, τι συμβαίνει;Είναι πιθανό να υπάρχει πρόβλημα μετο πείραμα της αντίστροφης μεταγραφής!Αν και φαίνεται ότι το πείραμα αντίστροφης μεταγραφής χρειάζεται μόνο να προσθέσει RNA, dNTP, εκκινητές καιαντίστροφη μεταγραφάσηστον σωλήνα φυγοκέντρησης και ανακατέψτε καλά, αλλά στην πραγματική διαδικασία λειτουργίας, υπάρχουν ακόμα πολλές λεπτομέρειες στις οποίες πρέπει να δοθεί προσοχή.Ας το μάθουμε!

Πώς να κρίνουμε την ποιότητα του RNA;
Για τη λήψη cDNA, η ποιότητα του RNA είναι κρίσιμη!Η ποιότητα του RNA μπορεί να ανιχνευθεί κυρίως από δύο πλευρές:
(1) Ακεραιότητα RNA:Η ακεραιότητα του RNA μπορεί να επαληθευτεί με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης. Λαμβάνοντας ως παράδειγμα τους ευκαρυώτες, το πλήρες συνολικό RNA έχει τρεις διαυγείς ζώνες, τα μοριακά βάρη από τα μεγάλα σε μικρά είναι 28S, 18S και 5S, και το 28S είναι δύο φορές πιο φωτεινό από το 18S.εάν διακρίνονται τρεις ζώνες, αλλά ο τύπος της ζώνης είναι θολή ή η διάχυση σημαίνει ότι το RNA είναι μερικώς αποικοδομημένο.Αυτή τη στιγμή, εκτελέστε αμέσως την αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής και αυξήστε κατάλληλα την είσοδο του προτύπου.εάν μπορεί να φανεί μόνο μια ζώνη με μικρό μοριακό βάρος ή καμία ζώνη, το RNA έχει αποικοδομηθεί πλήρως και χρειάζεται εκ νέου εκχύλιση.Το Agilent 2100 υποδεικνύει την ακεραιότητα του RNA με διάγραμμα κορυφής και τιμή RIN.Εάν το νουκλεϊκό οξύ είναι άθικτο, η γραμμή βάσης του ηλεκτροφερογράμματος είναι επίπεδη.Εάν το νουκλεϊκό οξύ υποβαθμίζεται σοβαρά, η βασική γραμμή είναι ανομοιόμορφη και εμφανίζονται περισσότερες κορυφές αποικοδόμησης.η τιμή του RIN αντανακλά την ακεραιότητα του RNA, εντός του εύρους 0-10, όσο μεγαλύτερη είναι η τιμή, τόσο καλύτερη είναι η ποιότητα του RNA.Λοιπόν, τόσο υψηλότερος είναι ο βαθμός πληρότητας.
(2) Καθαρότητα RNA:Η αναλογία OD260/280 μπορεί να ανιχνευθεί με φασματοφωτομετρία UV.Εάν η αναλογία OD260/280 είναι μεταξύ 1,9 και 2,1, η καθαρότητα είναι πολύ καλή.
Το υπολειμματικό γονιδιωματικό DNA μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή ποσοτικά αποτελέσματα
Όταν το RNA εξάγεται, το RNA που λαμβάνουμε μπορεί να αναμιχθεί με γονιδιωματικό DNA (gDNA) που δεν έχει καθαριστεί.Επομένως, το cDNA μετά την αντίστροφη μεταγραφή θα αναμιχθεί επίσης μεgDNA.Κατά την κατάντιαqPCRαντίδραση,cDNAκαι το gDNA μπορεί να ενισχυθεί ταυτόχρονα, με αποτέλεσμα μια σχετικά μικρή τιμή CT, επομένως τα αποτελέσματα μπορεί να είναι προκατειλημμένα.
Τι πρέπει να κάνουμε λοιπόν σε αυτή την κατάσταση;Foregeneπροτείνει:
(1) Εκτελέστε καθαρισμό γονιδιώματος στο ανάστροφο RNA, το οποίο μπορεί να αφαιρεθεί με εκχύλιση στήλης κατά την εκχύλιση RNA.
(2) Επεξεργαστείτε το εκχυλισμένο RNA με DNaseI , αλλά τερματίστε το με EDTA.
αντιδραστηρίων αντίστροφης μεταγραφήςμε μονάδες εκκαθάρισης γονιδιώματος.

Πώς να επιλέξετε εκκινητές για αντίστροφη μεταγραφή;
Οι εκκινητές αντίστροφης μεταγραφής επηρεάζουν επίσης το αποτέλεσμα της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής.Μπορείτε να επιλέξετε τυχαίους εκκινητές, Oligo dT ή γονιδιακούς εκκινητές για αντίστροφη μεταγραφή σύμφωνα με τις ειδικές συνθήκες του πειράματος:
(1) Συγκεκριμένες μεταγραφές: Συνιστώνται εκκινητές ειδικοί για γονίδια.
(2) Μεταγραφές μεγάλων αποσπασμάτων: Συνιστώνται εκκινητές Oligo dT/ειδικοί για γονίδιο.
(3) Εσωτερικά θραύσματα μεταγραφών μεγάλου τμήματος: γονιδιακά ειδικοί εκκινητές/ τυχαίοι εκκινητές /τυχαίοι εκκινητές + Oligo dT.Εάν εκτελεστεί το επόμενο πείραμα qPCR, το Oligo dT δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο του, επειδή η χρήση μόνο του Oligo dT μπορεί να προκαλέσει μεροληψία άκρου 3', οδηγώντας σε ανακριβή αποτελέσματα πειράματος qPCR.
(4) miRNA: Μπορούν να χρησιμοποιηθούν αστάρια στελέχους ή ουράς.

Πόσες φορές πρέπει να αραιωθεί το cDNA του προϊόντος αντίστροφης μεταγραφής για ποσοτικοποίηση;
Μετά τη λήψη του cDNA του προϊόντος αντίστροφης μεταγραφής, το πόσες φορές θα πρέπει να αραιωθεί το cDNA για τα πειράματα qPCR είναι πολύ σημαντικό.Εάν η συγκέντρωση cDNA είναι πολύ υψηλή ή πολύ χαμηλή, η απόδοση ενίσχυσης μπορεί να επηρεαστεί.Μπορεί να μετρηθεί η συγκέντρωση cDNA και πώς πρέπει να γίνει;
(1) Η συγκέντρωση cDNA του προϊόντος αντίστροφης μεταγραφής δεν μπορεί να μετρηθεί, επειδή εκτός από το προϊόν cDNA, το προϊόν αντίστροφης μεταγραφής περιέχει επίσης υπολειμματικό ρυθμιστικό διάλυμα αντίστροφης μεταγραφής, αντίστροφη μεταγραφάση, εκκινητές κ.λπ., τα οποία θα επηρεάσουν τα αποτελέσματα της μέτρησης της συγκέντρωσης και θα προκαλέσουν το OD260/280, ως εκ τούτου το OD260/ μη αληθές και το μη αληθές OD200D.Αυτή τη στιγμή, κάποιοι φίλοι θα πουν, τότε θα μετρήσω τη συγκέντρωση μετά τον καθαρισμό.Εδώ, η Foregene θα ήθελε να υπενθυμίσει ότι το cDNA δεν συνιστάται να καθαριστεί, επειδή το μήκος του cDNA που λαμβάνεται με την αναστροφή είναι διαφορετικό και το σύντομο cDNA θα χαθεί στον καθαρισμό.
(2) Τι να κάνετε λοιπόν;Πριν από το πείραμα qPCR, η βαθμίδα αραίωσης του cDNA μπορεί να προσδιοριστεί μέσω του προ-πειράματος.Για παράδειγμα: χρησιμοποιήστε μητρικό διάλυμα cDNA, 10πλάσια αραίωση και 100πλάσια αραίωση ως πρότυπα για πειράματα qPCR και επιλέξτε τον παράγοντα αραίωσης με τιμή CT στην περιοχή από 18-28.

Πώς πρέπει να γίνεται η αντίστροφη μεταγραφή των miRNA;
Το miRNA είναι ένα μονόκλωνο μικρό μόριο RNA με μέγεθος περίπου 22 nt που δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνη.Λόγω του μικρού μήκους της, η συμβατική μέθοδος qPCR είναι δύσκολο να ποσοτικοποιηθεί άμεσα, επομένως είναι συχνά απαραίτητη η επέκταση του miRNA.Οι ευρέως χρησιμοποιούμενες μέθοδοι αντίστροφης μεταγραφής για το miRNA περιλαμβάνουν τη μέθοδο stem-loop και τη μέθοδο ουράς.
Η μέθοδος stem-loop είναι η επέκταση του miRNA με την προσθήκη εκκινητών στελέχους-βρόχου.Αυτή η μέθοδος ανίχνευσης έχει υψηλότερη ευαισθησία και ειδικότητα, αλλά η απόδοση ανίχνευσης είναι χαμηλή.Μια αντίστροφη μεταγραφή μπορεί να ανιχνεύσει μόνο ένα miRNA και μια εσωτερική αναφορά.η μέθοδος προσθήκης ουράς αποτελείται από δύο Ολοκληρώνεται με την κοινή δράση δύο ενζύμων, τα οποία είναι η πολυμεράση PolyA και η ανάστροφη μεταγραφάση.Η πολυμεράση PolyA είναι υπεύθυνη για την προσθήκη ουρών PolyA στο miRNA για να αυξηθεί το μήκος του και η αντίστροφη μεταγραφάση εκτελεί αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής.Αυτή η μέθοδος έχει υψηλή απόδοση ανίχνευσης και μπορεί να ανιχνεύσει πολλαπλά miRNA και εσωτερικές αναφορές σε μία αντίστροφη μεταγραφή, αλλά η ευαισθησία και η ειδικότητα είναι χαμηλή στη μέθοδο stem-loop.