Ειδικότητα ανίχνευσης
Στις περισσότερες περιπτώσεις, ο σκοπός του σχεδιασμού εκκινητών είναι η μεγιστοποίηση της ειδικότητας της PCR.Αυτό καθορίζεται από την περισσότερο ή λιγότερο προβλέψιμη επιρροή πολλών μεταβλητών.Μια σημαντική μεταβλητή είναι η αλληλουχία στο 3' άκρο του εκκινητή.
Είναι σημαντικό ότι οι προσδιορισμοί PCR που έχουν σχεδιαστεί για εξειδίκευση είναι πιο πιθανό να διατηρήσουν υψηλή απόδοση σε ένα ευρύ δυναμικό εύρος, επειδή ο προσδιορισμός δεν παράγει μη ειδικά προϊόντα ενίσχυσης, ανταγωνιζόμενοι έτσι τα αντιδραστήρια PCR ή αναστέλλοντας την κύρια αντίδραση ενίσχυσης.
Φυσικά, σε ορισμένες περιπτώσεις, η εξειδίκευση δεν είναι το πιο σημαντικό, για παράδειγμα, όταν ο στόχος είναι να ποσοτικοποιηθούν στενά συνδεδεμένα αλλά διαφορετικά παθογόνα, απαιτούνται ειδικά πρότυπα σχεδίασης, βελτιστοποίησης και επαλήθευσης.
Η καμπύλη τήξης είναι μια τυπική μέθοδος για την αξιολόγηση της εξειδίκευσης των αμπλικονίων, τουλάχιστον όσον αφορά το εάν θα ενισχυθεί ένας μόνο στόχος.Ωστόσο, πρέπει να τονιστεί ότι οι καμπύλες τήξης μπορεί να είναι παραπλανητικές επειδή, για παράδειγμα, μπορούν να επηρεαστούν από τις συνδυασμένες επιδράσεις των μη βέλτιστων εκκινητών και των χαμηλών συγκεντρώσεων εκμαγείου.
P5 |Η καμπύλη τήξης δείχνει τις μετατοπίσεις Tm που λαμβάνονται από δύο ανιχνεύσεις διαφορετικών ποσοτήτων δύο DNA-στόχων.
Α. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (ad)), δεν υπάρχει εμφανές διμερές εκκινητή μετά την ολοκλήρωση της μέτρησης qPCR.Καθώς η συγκέντρωση του προτύπου μειώνεται στα 50 αντίγραφα (e), ένα μη ειδικό προϊόν αρχίζει να εμφανίζεται και γίνεται το μόνο προϊόν στη χαμηλότερη συγκέντρωση (f).
Β. Η δοκιμή κατέγραψε τα ίδια Tms σε όλες τις συγκεντρώσεις στόχου και δεν υπήρχε εμφανές διμερές εκκινητή ακόμα και στη χαμηλότερη συγκέντρωση (5 αντίγραφα).Κατά τη χρήση αυτών των δύο μεθόδων ανίχνευσης, δεν ανιχνεύθηκαν προϊόντα ενίσχυσης σε NTC.
Το P5 δείχνει τις καμπύλες διάλυσης που λαμβάνονται με δείγματα στα οποία το εκμαγείο υπάρχει σε διαφορετικές συγκεντρώσεις.Το P 5a δείχνει ότι στις δύο χαμηλότερες συγκεντρώσεις, τα Tms των μη ειδικών προϊόντων ενίσχυσης που παράγονται είναι χαμηλότερα από αυτά των ειδικών αμπλικονίων.
Προφανώς, αυτή η μέθοδος ανίχνευσης δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί αξιόπιστα για τον εντοπισμό στόχων που υπάρχουν σε χαμηλές συγκεντρώσεις.
Είναι ενδιαφέρον ότι τα NTC, δηλαδή δείγματα χωρίς καθόλου DNA, δεν κατέγραψαν (μη ειδικά) προϊόντα ενίσχυσης, υποδεικνύοντας ότι το γονιδιωματικό DNA του υποβάθρου μπορεί να συμμετέχει σε μη ειδική ενίσχυση/πολυμερισμό.
Μερικές φορές τέτοιοι εκκινητές υποβάθρου και μη ειδική ενίσχυση δεν μπορούν να αντιμετωπιστούν, αλλά είναι συχνά δυνατό να σχεδιαστεί μια μέθοδος ανίχνευσης που δεν έχει μη ειδική ενίσχυση σε καμία συγκέντρωση προτύπου και NTC (P 5b).
Εδώ, ακόμη και η καταγραφή της ενίσχυσης της συγκέντρωσης στόχου με Cq 35 θα παράγει μια συγκεκριμένη καμπύλη διάλυσης.Ομοίως, τα NTC δεν έδειξαν σημάδια μη ειδικής ενίσχυσης.Μερικές φορές, η συμπεριφορά ανίχνευσης μπορεί να εξαρτάται από το μητρικό υγρό και μόνο μη ειδική ενίσχυση ανιχνεύεται σε ορισμένες ρυθμιστικές συνθέσεις, οι οποίες μπορεί να σχετίζονται με διαφορετικές συγκεντρώσεις Mg2+.
Σταθερότητα ανίχνευσης
Η βελτιστοποίηση του Ta είναι ένα χρήσιμο βήμα στην εμπειρική επαλήθευση και τη διαδικασία βελτιστοποίησης της ανίχνευσης qPCR.Παρέχει μια άμεση ένδειξη της στιβαρότητας του σετ εκκινητών δείχνοντας τη θερμοκρασία (ή το εύρος θερμοκρασίας) που παράγει το χαμηλότερο Cq χωρίς να ενισχύει το NTC.
Η διπλάσια έως τετραπλάσια διαφορά στην ευαισθησία μπορεί να μην είναι σημαντική για άτομα με υψηλή έκφραση mRNA, αλλά για διαγνωστικά τεστ, μπορεί να σημαίνει τη διαφορά μεταξύ θετικών και ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων.
Οι ιδιότητες Ta των εκκινητών qPCR μπορεί να διαφέρουν πολύ.Ορισμένες δοκιμές δεν είναι πολύ εύρωστες και εάν δεν εκτελεστούν κάτω από τη βέλτιστη τιμή Ta των εκκινητών, θα καταρρεύσουν γρήγορα.
Αυτό είναι σημαντικό επειδή αυτός ο τύπος ανίχνευσης είναι συχνά προβληματικός στον πραγματικό κόσμο και η καθαρότητα του δείγματος, η συγκέντρωση του DNA ή η παρουσία άλλου DNA μπορεί να μην είναι βέλτιστη.
Επιπλέον, ο αριθμός αντιγράφου στόχου μπορεί να ποικίλλει σε μεγάλο εύρος και τα αντιδραστήρια, τα πλαστικά σκεύη ή τα όργανα μπορεί να διαφέρουν από αυτά που χρησιμοποιούνται κατά τη ρύθμιση της δοκιμής.
P6|Η διαβάθμιση θερμοκρασίας δείχνει τη διαφορετική στιβαρότητα της ανίχνευσης PCR.
Α. Χρησιμοποιήστε το mastermix Sensifast SYBR της Bioline (αριθμός καταλόγου BIO-98050) για να εκτελέσετε PCR σε cDNA που παρασκευάστηκε από RNA ανθρώπινου εγκεφάλου.
B. Χρησιμοποιήστε το όργανο CFX qPCR της Bio-Rad για να καταγράψετε τον χάρτη ενίσχυσης και την καμπύλη διάλυσης του απαλενίου (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
Γ. Γράφημα ενίσχυσης και καμπύλη τήξης του ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
Δ. Γράφημα ενίσχυσης και καμπύλη διάλυσης του GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCTCGTGGATCTTC).
Ε. Cqs που καταγράφηκαν σε διαφορετικές θερμοκρασίες ανόπτησης, δείχνοντας τη διαφορά στο Cq που καταγράφηκε κάτω από μια διαβάθμιση θερμοκρασίας 7C.
Το P 6 δείχνει ένα τυπικό αποτέλεσμα μιας ανεπιθύμητης δοκιμής, όπου το qPCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια βαθμίδωση Tas μεταξύ 59C και 67C (P 6a), χρησιμοποιώντας εκκινητές για τρία γονίδια ειδικά για τον ανθρώπινο εγκέφαλο.
Μπορεί να φανεί από το γράφημα ενίσχυσης ότι οι εκκινητές Opalin απέχουν πολύ από το να είναι ιδανικοί επειδή το βέλτιστο εύρος Ta τους είναι πολύ στενό (Εικόνα 6β), δηλαδή, τα Cqs είναι ευρέως διασκορπισμένα, με αποτέλεσμα τα Cqs να συγκρίνονται σημαντικά με το βέλτιστο Cqs Low.
Αυτή η μέθοδος ανίχνευσης είναι ασταθής και μπορεί να οδηγήσει σε μη βέλτιστη ενίσχυση.Επομένως, αυτό το ζεύγος εκκινητών θα πρέπει να επανασχεδιαστεί.Επιπλέον, η ανάλυση της καμπύλης τήξης (inset) δείχνει ότι η ειδικότητα αυτής της μεθόδου ανίχνευσης μπορεί επίσης να είναι προβληματική, επειδή η καμπύλη τήξης κάθε Ta είναι διαφορετική.
Η μέθοδος ανίχνευσης ACSBG1 που παρουσιάζεται στο P 6c είναι πιο ισχυρή από την παραπάνω μέθοδο ανίχνευσης Opalin, αλλά απέχει πολύ από την ιδανική και είναι πιθανό να μπορεί να βελτιωθεί.
Ωστόσο, τονίζουμε ότι δεν υπάρχει απαραίτητη σύνδεση μεταξύ της ευρωστίας και της ειδικότητας, επειδή η καμπύλη διάλυσης που παράγεται από αυτήν τη μέθοδο ανίχνευσης δείχνει την ίδια τιμή κορυφής σε όλα τα Tas (inset).
Από την άλλη πλευρά, η δοκιμή ευρωστίας είναι πολύ πιο ανεκτική, παράγοντας παρόμοια Cqs σε ένα ευρύ φάσμα Tas, όπως στη δοκιμή GFAP που φαίνεται στο P 6d.
Η διαφορά στα Cqs που λαμβάνεται στο ίδιο εύρος 8 βαθμών Κελσίου είναι μικρότερη από 1 και η καμπύλη διάλυσης (ένθετη) επιβεβαιώνει τα χαρακτηριστικά ανίχνευσης σε αυτό το εύρος θερμοκρασίας.Αξίζει να σημειωθεί ότι το υπολογισμένο εύρος Tas και το πραγματικό εύρος Ta μπορεί να διαφέρουν πολύ.
Υπάρχουν πολλές κατευθυντήριες γραμμές που έχουν σχεδιαστεί για να βοηθήσουν τους ερευνητές να σχεδιάσουν αποτελεσματικά primers, τα περισσότερα από τα οποία βασίζονται σε μακροχρόνιους κανόνες και έχει δοθεί μεγάλη προσοχή στο 3'τέλος των εκκινητών.Συχνά συνιστάται να συμπεριλάβετε ένα G ή C στο άκρο 3' και δύο βάσεις G ή C (σφιγκτήρας GC), αλλά όχι περισσότερες από δύο από τις τελευταίες 5 βάσεις.
Στην πράξη, αυτοί οι κανόνες μπορούν να καθοδηγήσουν τους ερευνητές, αλλά δεν είναι απαραίτητα σωστοί υπό όλες τις συνθήκες.
P7 |Το 3' άκρο του εκκινητή έχει μικρή επίδραση στην ειδικότητα ή την αποτελεσματικότητα.
Α. Η θέση των εκκινητών για το ανθρώπινο γονίδιο HIF-1α (NM_181054.2).
B. Χρησιμοποιήστε το μητρικό υγρό Agilent Brilliant III SYBR Green (Κατ. Αρ. 600882) για να ενισχύσετε έξι δοκιμαστικά στοιχεία.
Γ. Γράφημα ενίσχυσης και καμπύλη τήξης που καταγράφηκε από το όργανο CFX qPCR της Bio-Rad και τους εκκινητές 3'.Τα NTC εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα.
Δ. Καταγραφή Cq για κάθε αντικείμενο δοκιμής
Για παράδειγμα, το αποτέλεσμα στο P 7 έρχεται σε αντίθεση με τον κανόνα 3'end.Όλα τα σχέδια παράγουν βασικά τα ίδια αποτελέσματα, με μόνο δύο συνδυασμούς εκκινητών που οδηγούν σε μη ειδική ενίσχυση στο NTC.
Ωστόσο, δεν μπορούμε να υποστηρίξουμε το εφέ του κλιπ GC, γιατί σε αυτήν την περίπτωση, η χρήση A ή T ως μέγιστο 30 βάσεων δεν μειώνει την εξειδίκευση.
Η δοκιμή C, όπου ο εκκινητής F τελειώνει σε GGCC, κατέγραψε Cqs σε NTC, υποδεικνύοντας ότι κάποιος μπορεί να θέλει να αποφύγει αυτές τις αλληλουχίες στο 30-άκρο.Τονίζουμε ότι ο μόνος τρόπος για να προσδιοριστεί η καλύτερη 3'-τελική αλληλουχία ενός ζεύγους εκκινητών είναι να αξιολογηθούν πειραματικά ορισμένοι υποψήφιοι εκκινητές.
Αποδοτικότητα ενίσχυσης
Είναι σημαντικό, αν και η μη ειδική ανίχνευση PCR δεν μπορεί ποτέ να γίνει ειδική, η απόδοση ενίσχυσης μπορεί να ρυθμιστεί και να μεγιστοποιηθεί με πολλούς διαφορετικούς τρόπους αλλάζοντας το ένζυμο, το μητρικό υγρό, τα πρόσθετα και τις συνθήκες κύκλου.
Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της ανίχνευσης PCR, είναι καλύτερο να χρησιμοποιηθεί μια σειριακή αραίωση 10 ή 5 φορές του νουκλεϊκού οξέος στόχου, δηλαδή η «μέθοδος τυπικής καμπύλης».
Εάν χρησιμοποιούνται αμπλικόνια PCR ή στόχοι συνθετικού DNA για τη δημιουργία μιας τυπικής καμπύλης, οι σειριακές αραιώσεις αυτών των στόχων θα πρέπει να αναμιγνύονται με μια σταθερή ποσότητα DNA υποβάθρου (όπως γονιδιωματικό DNA).
P8 |Καμπύλη αραίωσης για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της PCR.
Α. Χρησιμοποιήστε εκκινητές για HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA και R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC και Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (αριθμός καταλόγου 600882) για PCR και συνθήκες καμπύλης τήξης.
Β. 100 ng RNA μεταγράφηκαν αντίστροφα, αραιώθηκαν 2 φορές και σειριακά αραιωμένα δείγματα cDNA αραιώθηκαν 5 φορές σε 1 ng ανθρώπινου γονιδιωματικού DNA.Η καμπύλη τήξης φαίνεται στο ένθετο.
C. Η αντίδραση RT, η αραίωση και η σειριακή αραίωση επαναλήφθηκαν για το δεύτερο δείγμα cDNA και τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια.
Το P 8 δείχνει δύο τυπικές καμπύλες, χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο ανίχνευσης σε δύο διαφορετικά δείγματα cDNA, το αποτέλεσμα είναι η ίδια απόδοση, περίπου 100%, και η τιμή R2 είναι επίσης παρόμοια, δηλαδή ο βαθμός προσαρμογής μεταξύ των πειραματικών δεδομένων και της γραμμής παλινδρόμησης ή ο Βαθμός γραμμικότητας δεδομένων.
Οι δύο τυπικές καμπύλες είναι συγκρίσιμες, αλλά όχι ακριβώς ίδιες.Εάν ο σκοπός είναι να ποσοτικοποιηθεί με ακρίβεια ο στόχος, πρέπει να σημειωθεί ότι είναι απαράδεκτο να παρέχεται υπολογισμός αριθμού αντιγράφων χωρίς να εξηγείται η αβεβαιότητα
P9 |Αβεβαιότητα μέτρησης που σχετίζεται με ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας μια τυπική καμπύλη.
Α. Χρησιμοποιήστε εκκινητές για GAPDH (NM_002046) για να εκτελέσετε συνθήκες PCR και καμπύλης τήξης.F: ACAGTTGCCATGTAGACC και R: TAACTGGTTGAGCACAGG και Mastermix Sensifast SYBR της Bioline (αριθμός καταλόγου BIO-98050).
Β. Διάγραμμα ενίσχυσης, καμπύλη τήξης και τυπική καμπύλη που καταγράφηκε με το όργανο CFX qPCR της Bio-Rad.
Γ. Γράφημα τυπικής καμπύλης και διάστημα εμπιστοσύνης 95% (CI).
Δ. Ο αριθμός αντιγράφων και το διάστημα εμπιστοσύνης 95% των τριών τιμών Cq που προέρχονται από την καμπύλη αραίωσης.
Το P 9 δείχνει ότι για μια βελτιστοποιημένη δοκιμή, η εγγενής μεταβλητότητα μιας απλής τυπικής καμπύλης είναι περίπου 2 φορές (95% διάστημα εμπιστοσύνης, ελάχιστο έως μέγιστο), που μπορεί να είναι η μικρότερη μεταβλητότητα που μπορεί να αναμένεται.
Σχετικό προϊόν:
Ώρα δημοσίευσης: Σεπ-30-2021
