Το RT-qPCR αναπτύχθηκε από τη συνηθισμένη τεχνολογία PCR.Προσθέτει φθορίζουσες χημικές ουσίες (φθορίζουσες βαφές ή φθορίζοντες ανιχνευτές) στο παραδοσιακό σύστημα αντίδρασης PCR και ανιχνεύει τη διαδικασία ανόπτησης και επέκτασης PCR σε πραγματικό χρόνο σύμφωνα με τους διαφορετικούς μηχανισμούς φωταύγειας.Οι αλλαγές σήματος φθορισμού στο μέσο χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της ποσότητας της αλλαγής του προϊόντος σε κάθε κύκλο PCR.Επί του παρόντος, οι πιο κοινές μέθοδοι είναι η μέθοδος φθορίζουσας βαφής και η μέθοδος ανιχνευτή.

Μέθοδος φθορίζουσας βαφής:
Ορισμένες φθορίζουσες βαφές, όπως το SYBR Green Ⅰ, το PicoGreen, το BEBO, κ.λπ., δεν εκπέμπουν φως από μόνες τους, αλλά εκπέμπουν φθορισμό μετά τη δέσμευση στο δευτερεύον αυλάκι του dsDNA.Επομένως, στην αρχή της αντίδρασης PCR, το μηχάνημα δεν μπορεί να ανιχνεύσει το φθορίζον σήμα.Όταν η αντίδραση προχωρήσει στο στάδιο ανόπτησης-επέκτασης (μέθοδος δύο σταδίων) ή επέκτασης (μέθοδος τριών σταδίων), οι διπλοί κλώνοι ανοίγουν αυτή τη στιγμή και η νέα πολυμεράση DNA Κατά τη σύνθεση του κλώνου, τα φθορίζοντα μόρια συνδυάζονται στη δευτερεύουσα αύλακα dsDNA και εκπέμπουν φθορισμό.Καθώς ο αριθμός των κύκλων PCR αυξάνεται, όλο και περισσότερες βαφές συνδυάζονται με το dsDNA και το σήμα φθορισμού ενισχύεται επίσης συνεχώς.Πάρτε για παράδειγμα το SYBR Green Ⅰ.
Μέθοδος ανίχνευσης:
Ο ανιχνευτής Taqman είναι ο πιο συχνά χρησιμοποιούμενος ανιχνευτής υδρόλυσης.Υπάρχει μια φθορίζουσα ομάδα στο 5' άκρο του καθετήρα, συνήθως FAM.Ο ίδιος ο ανιχνευτής είναι μια αλληλουχία συμπληρωματική του γονιδίου στόχου.Υπάρχει μια φθορίζουσα ομάδα σβέσης στο 3' άκρο του φθοροφόρου.Σύμφωνα με την αρχή της μεταφοράς ενέργειας συντονισμού φθορισμού (μεταφορά ενέργειας συντονισμού Förster, FRET), όταν η ομάδα φθορισμού ανταποκριτή (φθορίζον μόριο δότη) και η ομάδα φθορισμού σβέσης (φθορίζον μόριο δέκτη) Όταν το φάσμα διέγερσης επικαλύπτεται και η απόσταση του μορίου είναι πολύ κοντά (7-10). φθορισμού του μορίου δέκτη, ενώ ο αυτοφθορισμός εξασθενεί.Επομένως, στην αρχή της αντίδρασης PCR, όταν ο ανιχνευτής είναι ελεύθερος και άθικτος στο σύστημα, η ομάδα φθορισμού αναφοράς δεν θα εκπέμψει φθορισμό.Κατά την ανόπτηση, το αστάρι και ο ανιχνευτής συνδέονται με το πρότυπο.Κατά τη διάρκεια του σταδίου επέκτασης, η πολυμεράση συνθέτει συνεχώς νέες αλυσίδες.Η DNA πολυμεράση έχει δραστικότητα εξωνουκλεάσης 5'-3'.Όταν φτάσει στον ανιχνευτή, η DNA πολυμεράση θα υδρολύσει τον ανιχνευτή από το εκμαγείο, θα διαχωρίσει τη φθορίζουσα ομάδα αναφοράς από τη φθορίζουσα ομάδα απόσβεσης και θα απελευθερώσει το φθορίζον σήμα.Δεδομένου ότι υπάρχει μια σχέση ένα προς ένα μεταξύ του ανιχνευτή και του εκμαγείου, η μέθοδος ανιχνευτή είναι ανώτερη από τη μέθοδο βαφής όσον αφορά την ακρίβεια και την ευαισθησία της δοκιμής.

Εικ. 1 Αρχή της qRT-PCR

Σχέδιο αστάρι
Αρχές:

Οι εκκινητές θα πρέπει να σχεδιάζονται στη διατηρημένη περιοχή της σειράς νουκλεϊκών οξέων και να έχουν ειδικότητα.

Είναι καλύτερο να χρησιμοποιείται η αλληλουχία cDNA και η αλληλουχία mRNA είναι επίσης αποδεκτή.Εάν όχι, ανακαλύψτε τον σχεδιασμό της περιοχής cds της αλληλουχίας DNA.
Το μήκος του φθορίζοντος ποσοτικού προϊόντος είναι 80-150 bp, το μεγαλύτερο είναι 300 bp, το μήκος του εκκινητή είναι γενικά μεταξύ 17-25 βάσεων και η διαφορά μεταξύ του ανάντη και του κατάντη εκκινητών δεν πρέπει να είναι πολύ μεγάλη.

Η περιεκτικότητα σε G+C είναι μεταξύ 40% και 60%, και το 45-55% είναι το καλύτερο.
Η τιμή TM είναι μεταξύ 58-62 μοίρες.
Προσπαθήστε να αποφύγετε διμερή και αυτοδιμερή εκκινητών, (δεν εμφανίζονται περισσότερα από 4 ζεύγη διαδοχικών συμπληρωματικών βάσεων) δομή φουρκέτας, εάν είναι αναπόφευκτη, κάντε ΔG<4,5kJ/mol* Εάν δεν μπορείτε να διασφαλίσετε ότι το gDNA έχει αφαιρεθεί κατά τη διάρκεια της αντίστροφης μεταγραφής Καθαρίστε, είναι καλύτερο να σχεδιάσετε τους εκκινητές της περιοχής *3, άκρο της περιοχής για να αποφεύγεται. /C, A/G συνεχούς δομής (2-3) αστάρια και μη
ειδική Η ομολογία της ετερογενώς ενισχυμένης αλληλουχίας είναι κατά προτίμηση μικρότερη από 70% ή έχει ομολογία 8 συμπληρωματικών βάσεων.
Βάση δεδομένων:
Αναζήτηση CottonFGD με λέξεις-κλειδιά
Σχεδιασμός ασταριού:
Σχεδιασμός εκκινητών IDT-qPCR

Σχήμα 2 Σελίδα εργαλείων σχεδιασμού ασταριού διαδικτυακού IDT

Σχήμα 3 Εμφάνιση σελίδας αποτελεσμάτων
Σχεδιασμός εκκινητών lncRNA:
lncRNA:τα ίδια βήματα με το mRNA.
miRNA:Η αρχή της μεθόδου stem-loop: Δεδομένου ότι όλα τα miRNA είναι σύντομες αλληλουχίες περίπου 23 nt, δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί άμεση ανίχνευση PCR, επομένως χρησιμοποιείται το εργαλείο ακολουθίας στελέχους-βρόχου.Η αλληλουχία στελέχους-βρόχου είναι ένα μονόκλωνο DNA περίπου 50 nt, το οποίο μπορεί να σχηματίσει μια δομή φουρκέτας από μόνη της.3 'Το άκρο μπορεί να σχεδιαστεί ως αλληλουχία συμπληρωματική του μερικού θραύσματος miRNA, στη συνέχεια το στοχευόμενο miRNA μπορεί να συνδεθεί με την αλληλουχία βρόχου στελέχους κατά τη διάρκεια της αντίστροφης μεταγραφής και το συνολικό μήκος μπορεί να φτάσει τα 70 bp, που είναι σύμφωνο με το μήκος του ενισχυμένου προϊόντος που προσδιορίζεται με qPCR.Σχέδιο εκκινητή miRNA ουράς .
Ανίχνευση ειδικής ενίσχυσης:
Online blast database: CottonFGD blast by sequence ομοιότητα
Τοπική έκρηξη: Ανατρέξτε στη χρήση του Blast+ για τοπική έκρηξη, το Linux και τα macos μπορούν να δημιουργήσουν απευθείας μια τοπική βάση δεδομένων, το σύστημα win10 μπορεί επίσης να γίνει μετά την εγκατάσταση του ubuntu bash.Δημιουργία τοπικής βάσης δεδομένων blast και τοπικής έκρηξης.ανοίξτε το ubuntu bash στο win10.
Σημείωση: Το ορεινό βαμβάκι και το βαμβάκι θαλάσσιων νησιών είναι τετραπλοειδείς καλλιέργειες, επομένως το αποτέλεσμα της έκρηξης θα είναι συχνά δύο ή περισσότερα σπίρτα.Στο παρελθόν, η χρήση των CD NAU ως βάσης δεδομένων για την εκτέλεση blast είναι πιθανό να βρει δύο ομόλογα γονίδια με λίγες μόνο διαφορές SNP.Συνήθως, τα δύο ομόλογα γονίδια δεν μπορούν να διαχωριστούν με σχεδιασμό εκκινητών, επομένως αντιμετωπίζονται ως ίδια.Εάν υπάρχει εμφανές indel, το primer σχεδιάζεται συνήθως στο indel, αλλά αυτό μπορεί να οδηγήσει στη δευτερεύουσα δομή του αστάρι. Η ελεύθερη ενέργεια γίνεται υψηλότερη, οδηγώντας σε μείωση της απόδοσης ενίσχυσης, αλλά αυτό είναι αναπόφευκτο.

Ανίχνευση δευτερογενούς δομής εκκινητή:
Βήματα:άνοιγμα oligo 7 → ακολουθία προτύπου εισαγωγής → κλείσιμο υποπαραθύρου → αποθήκευση → εντοπισμός εκκινητή στο πρότυπο, πατήστε ctrl+D για να ορίσετε το μήκος του αστάρι → αναλύστε διάφορες δευτερεύουσες δομές, όπως σώμα αυτοδιμερισμού, ετεροδιμερές, φουρκέτα, ασυμφωνία κ.λπ. Οι δύο τελευταίες εικόνες στο Σχήμα 4 είναι τα αποτελέσματα δοκιμής εκκινητών.Το αποτέλεσμα του μπροστινού ασταριού είναι καλό, δεν υπάρχει εμφανής δομή διμερούς και φουρκέτας, δεν υπάρχουν συνεχείς συμπληρωματικές βάσεις και η απόλυτη τιμή ελεύθερης ενέργειας είναι μικρότερη από 4,5, ενώ το πίσω αστάρι δείχνει συνεχές Οι 6 βάσεις είναι συμπληρωματικές και η ελεύθερη ενέργεια είναι 8,8.Επιπλέον, ένα πιο σοβαρό διμερές εμφανίζεται στο άκρο 3′ και εμφανίζεται ένα διμερές 4 διαδοχικών βάσεων.Αν και η ελεύθερη ενέργεια δεν είναι υψηλή, το 3' διμερές Chl μπορεί να επηρεάσει σοβαρά την ειδικότητα ενίσχυσης και την απόδοση ενίσχυσης.Επιπλέον, είναι απαραίτητο να ελέγξετε για φουρκέτες, ετεροδιμερή και αναντιστοιχίες.

Αποτελέσματα ανίχνευσης του Σχ. 3 oligo7
Ανίχνευση απόδοσης ενίσχυσης:
Η αποτελεσματικότητα ενίσχυσης της αντίδρασης PCR επηρεάζει σοβαρά τα αποτελέσματα της PCR.Επίσης στην qRT-PCR, η απόδοση ενίσχυσης είναι ιδιαίτερα σημαντική για τα ποσοτικά αποτελέσματα.Αφαιρέστε άλλες ουσίες, μηχανές και πρωτόκολλα στο ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης.Η ποιότητα των εκκινητών έχει επίσης μεγάλη επίδραση στην αποτελεσματικότητα ενίσχυσης της qRT-PCR.Προκειμένου να διασφαλιστεί η ακρίβεια των αποτελεσμάτων, τόσο η σχετική ποσοτικοποίηση φθορισμού όσο και η ποσοτικοποίηση απόλυτου φθορισμού πρέπει να ανιχνεύσουν την αποτελεσματικότητα ενίσχυσης των εκκινητών.Αναγνωρίζεται ότι η αποτελεσματική απόδοση ενίσχυσης qRT-PCR είναι μεταξύ 85% και 115%.Υπάρχουν δύο μέθοδοι:
1. Τυπική μέθοδος καμπύλης:
ένα.Αναμείξτε cDNA
σι.Διαβάθμιση αραίωσης
c.qPCR
ρε.Εξίσωση γραμμικής παλινδρόμησης για τον υπολογισμό της απόδοσης ενίσχυσης
2. LinRegPCR
Το LinRegPCR είναι ένα πρόγραμμα για την ανάλυση δεδομένων RT-PCR σε πραγματικό χρόνο, που ονομάζονται επίσης δεδομένα ποσοτικής PCR (qPCR) με βάση το SYBR Green ή παρόμοια χημεία.Το πρόγραμμα χρησιμοποιεί μη-βασικά διορθωμένα δεδομένα, εκτελεί μια διόρθωση γραμμής βάσης σε κάθε δείγμα χωριστά, προσδιορίζει ένα παράθυρο γραμμικότητας και στη συνέχεια χρησιμοποιεί ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης για να χωρέσει μια ευθεία γραμμή μέσω του συνόλου δεδομένων PCR.Από την κλίση αυτής της γραμμής υπολογίζεται η αποτελεσματικότητα PCR κάθε μεμονωμένου δείγματος.Η μέση απόδοση της PCR ανά αμπλικόνιο και η τιμή Ct ανά δείγμα χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό μιας αρχικής συγκέντρωσης ανά δείγμα, εκφρασμένη σε αυθαίρετες μονάδες φθορισμού.Η εισαγωγή και η έξοδος δεδομένων γίνονται μέσω υπολογιστικού φύλλου Excel.Μόνο δείγμα
απαιτείται ανάμειξη, χωρίς κλίση
απαιτούνται βήματα:(Πάρτε για παράδειγμα το Bole CFX96, όχι εντελώς Μηχανή με καθαρό ABI)
πείραμα:είναι ένα τυπικό πείραμα qPCR.
Έξοδος δεδομένων qPCR:Το LinRegPCR μπορεί να αναγνωρίσει δύο μορφές αρχείων εξόδου: RDML ή ποσοτικοποίηση Αποτέλεσμα ενίσχυσης.Στην πραγματικότητα, είναι η τιμή ανίχνευσης σε πραγματικό χρόνο του αριθμού κύκλου και του σήματος φθορισμού από το μηχάνημα και η ενίσχυση λαμβάνεται με ανάλυση της τιμής αλλαγής φθορισμού της απόδοσης του γραμμικού τμήματος.
Επιλογή δεδομένων: Θεωρητικά, η τιμή RDML θα πρέπει να μπορεί να χρησιμοποιηθεί.Υπολογίζεται ότι το πρόβλημα του υπολογιστή μου είναι ότι το λογισμικό δεν μπορεί να αναγνωρίσει το RDML, επομένως έχω την τιμή εξόδου excel ως τα αρχικά δεδομένα.Συνιστάται να κάνετε πρώτα μια πρόχειρη εξέταση των δεδομένων, όπως αποτυχία προσθήκης δειγμάτων κ.λπ. Τα σημεία μπορούν να διαγραφούν στα δεδομένα εξόδου (φυσικά, δεν μπορείτε να τα διαγράψετε, το LinRegPCR θα αγνοήσει αυτά τα σημεία στο επόμενο στάδιο)

Σχήμα 5 Εξαγωγή δεδομένων qPCR

Εικ6 επιλογή υποψήφιων δειγμάτων

Εισαγωγή δεδομένων:Ανοίξτε τα αποτελέσματα ενίσχυσης πιστοποίησης.xls, → ανοίξτε το LinRegPCR → αρχείο → ανάγνωση από το excel → επιλέξτε παραμέτρους όπως φαίνεται στην Εικόνα 7 → OK → κάντε κλικ στον προσδιορισμό βασικών γραμμών

Σχήμα 7 βήματα εισαγωγής δεδομένων linRegPCR

Αποτέλεσμα:Εάν δεν υπάρχει επανάληψη, δεν απαιτείται ομαδοποίηση.Εάν υπάρχει επανάληψη, η ομαδοποίηση μπορεί να τροποποιηθεί στην ομαδοποίηση δειγμάτων και το όνομα του γονιδίου εισάγεται στο αναγνωριστικό και, στη συνέχεια, το ίδιο γονίδιο θα ομαδοποιηθεί αυτόματα.Τέλος, κάντε κλικ στο αρχείο, εξάγετε το excel και δείτε τα αποτελέσματα.Θα εμφανιστούν η απόδοση ενίσχυσης και τα αποτελέσματα R2 κάθε φρεατίου.Δεύτερον, εάν χωρίσετε σε ομάδες, θα εμφανιστεί η διορθωμένη μέση απόδοση ενίσχυσης.Βεβαιωθείτε ότι η απόδοση ενίσχυσης κάθε εκκινητή είναι μεταξύ 85% και 115%.Εάν είναι πολύ μεγάλο ή πολύ μικρό, σημαίνει ότι η απόδοση ενίσχυσης του εκκινητή είναι κακή.

Σχήμα 8 Αποτέλεσμα και έξοδος δεδομένων

Πειραματική διαδικασία:
Απαιτήσεις ποιότητας RNA:
Καθαρότητα:1.7Το 2,0 δείχνει ότι μπορεί να υπάρχει υπολειμματικό ισοθειοκυανικό.Το καθαρό νουκλεϊκό οξύ A260/A230 πρέπει να είναι περίπου 2 . Εάν υπάρχει ισχυρή απορρόφηση στα 230 nm, σημαίνει ότι υπάρχουν οργανικές ενώσεις όπως τα ιόντα φαινικού.Επιπλέον, μπορεί να ανιχνευθεί με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης 1,5%.Δείξτε τον δείκτη, επειδή το ssRNA δεν έχει μετουσίωση και ο λογάριθμος μοριακού βάρους δεν έχει γραμμική σχέση και το μοριακό βάρος δεν μπορεί να εκφραστεί σωστά.Συγκέντρωση: Θεωρητικάδενλιγότερο από 100 ng/ul, εάν η συγκέντρωση είναι πολύ χαμηλή, η καθαρότητα είναι γενικά χαμηλή και όχι υψηλή

Σχήμα 9 γέλη RNA

Επιπλέον, εάν το δείγμα είναι πολύτιμο και η συγκέντρωση του RNA είναι υψηλή, συνιστάται η μερίδα του μετά την εκχύλιση και η αραίωση του RNA σε τελική συγκέντρωση 100-300 ng/ul για αντίστροφη μεταγραφή.Σεη διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής, όταν μεταγράφεται το mRNA, οι εκκινητές ολίγο (dt) που μπορούν να συνδεθούν ειδικά με ουρές polyA χρησιμοποιούνται για αντίστροφη μεταγραφή, ενώ το lncRNA και το circRNA χρησιμοποιούν τυχαίους εξαμερείς εκκινητές (Random 6 mer) για την αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA Για το miRNA, οι ειδικοί για miRNA εκκινητές λαιμού χρησιμοποιούνται rescriptn-loopverse.Πολλές εταιρείες έχουν πλέον κυκλοφορήσει ειδικά κιτ ουράς.Για τη μέθοδο stem-loop, η μέθοδος tailing είναι πιο βολική, υψηλής απόδοσης και εξοικονόμησης αντιδραστηρίων, αλλά το αποτέλεσμα της διάκρισης των miRNAs της ίδιας οικογένειας δεν πρέπει να είναι τόσο καλό όσο η μέθοδος stem-loop.Κάθε κιτ αντίστροφης μεταγραφής έχει απαιτήσεις για τη συγκέντρωση ειδικών για το γονίδιο εκκινητών (στέλεχος-βρόγχοι).Η εσωτερική αναφορά που χρησιμοποιείται για το miRNA είναι το U6.Στη διαδικασία αναστροφής στελέχους-βρόχου, ένας σωλήνας U6 θα πρέπει να αντιστραφεί ξεχωριστά και τα μπροστινά και πίσω αστάρια του U6 θα πρέπει να προστεθούν απευθείας.Τόσο το circRNA όσο και το lncRNA μπορούν να χρησιμοποιούν HKG ως εσωτερική αναφορά.Σεανίχνευση cDNA,
Εάν δεν υπάρχει πρόβλημα με το RNA, το cDNA θα πρέπει επίσης να είναι εντάξει.Ωστόσο, εάν επιδιώκεται η τελειότητα του πειράματος, είναι καλύτερο να χρησιμοποιηθεί ένα εσωτερικό γονίδιο αναφοράς (γονίδιο αναφοράς, RG) που μπορεί να διακρίνει το gDNA από το cds.Γενικά, το RG είναι ένα γονίδιο νοικοκυριού., HKG) όπως φαίνεται στο Σχήμα 10.Εκείνη την εποχή, έφτιαχνα πρωτεΐνη αποθήκευσης σόγιας και χρησιμοποιούσα ιντρόνια που περιείχαν ακτίνη7 ως εσωτερική αναφορά.Το μέγεθος του ενισχυμένου θραύσματος αυτού του εκκινητή σε gDNA ήταν 452 bp και εάν χρησιμοποιήθηκε cDNA ως πρότυπο, ήταν 142 bp.Στη συνέχεια, τα αποτελέσματα των δοκιμών διαπίστωσαν ότι μέρος του cDNA ήταν πράγματι μολυσμένο από gDNA και απέδειξε επίσης ότι δεν υπήρχε πρόβλημα με το αποτέλεσμα της αντίστροφης μεταγραφής και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο για PCR.Είναι άχρηστο να εκτελείται ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης απευθείας με cDNA και είναι μια διάχυτη ζώνη, η οποία δεν είναι πειστική.

Εικ. 10 Ανίχνευση cDNA

Ο προσδιορισμός των συνθηκών qPCRγενικά δεν υπάρχει πρόβλημα σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κιτ, κυρίως στο βήμα της τιμής tm.Εάν ορισμένοι εκκινητές δεν είναι καλά σχεδιασμένοι κατά τη σχεδίαση εκκινητών, με αποτέλεσμα μεγάλη διαφορά μεταξύ της τιμής tm και των θεωρητικών 60°C, συνιστάται το cDNA Αφού αναμειχθούν τα δείγματα, να εκτελέσετε μια βαθμιδωτή PCR με εκκινητές και προσπαθήστε να αποφύγετε τη ρύθμιση της θερμοκρασίας χωρίς ζώνες ως τιμή TM.

Ανάλυση δεδομένων

Η συμβατική μέθοδος επεξεργασίας ποσοτικής PCR σχετικού φθορισμού είναι βασικά σύμφωνα με το 2-ΔΔCT.Πρότυπο επεξεργασίας δεδομένων.

Σχετικά προϊόντα:

Εύκολη PCR σε πραγματικό χρόνο^TM – Τακμάν

Εύκολη PCR σε πραγματικό χρόνο^TM – SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix για σύνθεση cDNA πρώτου κλώνου)

RT Easy II (Master Premix για σύνθεση cDNA πρώτου κλώνου για qPCR)