Αρχικό υλικό: RNA

Η ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής (RT-qPCR) είναι μια πειραματική μέθοδος που χρησιμοποιείται σε πειράματα PCR χρησιμοποιώντας RNA ως υλικό έναρξης.Σε αυτή τη μέθοδο, ολικό RNA ή αγγελιαφόρο RNA (mRNA) μεταγράφεται πρώτα σε συμπληρωματικό DNA (cDNA) με ανάστροφη μεταγραφάση.Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μια αντίδραση qPCR χρησιμοποιώντας το cDNA ως εκμαγείο.Το RT-qPCR έχει χρησιμοποιηθεί σε μια ποικιλία εφαρμογών μοριακής βιολογίας, συμπεριλαμβανομένης της ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης, της επικύρωσης παρεμβολής RNA, της επικύρωσης μικροσυστοιχιών, της ανίχνευσης παθογόνων, των γενετικών δοκιμών και της έρευνας ασθενειών.

Μέθοδοι ενός σταδίου και δύο σταδίων για RT-qPCR

Η RT-qPCR μπορεί να επιτευχθεί με μια μέθοδο ενός σταδίου ή δύο σταδίων.Η RT-qPCR ενός σταδίου συνδυάζει την αντίστροφη μεταγραφή και την ενίσχυση PCR, επιτρέποντας στην ανάστροφη μεταγραφάση και την πολυμεράση DNA να ολοκληρώσουν την αντίδραση στον ίδιο σωλήνα υπό τις ίδιες συνθήκες ρυθμιστικού διαλύματος.Η RT-qPCR ενός σταδίου απαιτεί μόνο τη χρήση ειδικών για την αλληλουχία εκκινητών.Σε δύο σταδίων RT-qPCR, η αντίστροφη μεταγραφή και η ενίσχυση PCR εκτελούνται σε δύο σωλήνες, χρησιμοποιώντας διαφορετικά βελτιστοποιημένα ρυθμιστικά διαλύματα, συνθήκες αντίδρασης και στρατηγικές σχεδιασμού εκκινητών.

Σχετικά προϊόντα:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Ένα Βήμα)-SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Ένα Βήμα)-Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master Premix For First-Strand CDNA Synthesis

Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman

Επιλογή ολικού RNA και mRNA

Κατά το σχεδιασμό ενός πειράματος RT-qPCR, είναι σημαντικό να αποφασίσετε εάν θα χρησιμοποιήσετε ολικό RNA ή καθαρισμένο mRNA ως πρότυπο για την αντίστροφη μεταγραφή.Αν και το mRNA μπορεί να παρέχει ελαφρώς υψηλότερη ευαισθησία, το ολικό RNA εξακολουθεί να χρησιμοποιείται συχνά.Ο λόγος για αυτό είναι ότι το συνολικό RNA έχει πιο σημαντικό πλεονέκτημα ως πρώτη ύλη από το mRNA.Πρώτον, η διαδικασία απαιτεί λιγότερα στάδια καθαρισμού, γεγονός που εξασφαλίζει καλύτερη ποσοτική ανάκτηση του προτύπου και καλύτερη κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων στους αριθμούς των κυττάρων έναρξης.Δεύτερον, αποφεύγει το βήμα εμπλουτισμού mRNA, το οποίο μπορεί να αποφύγει την πιθανότητα λοξών αποτελεσμάτων λόγω διαφορετικών ανακτήσεων διαφορετικών mRNA.Συνολικά, δεδομένου ότι στις περισσότερες εφαρμογές η σχετική ποσοτικοποίηση του γονιδίου στόχου είναι πιο σημαντική από την απόλυτη ευαισθησία της ανίχνευσης, το συνολικό RNA είναι πιο κατάλληλο στις περισσότερες περιπτώσεις.

Εκκινητής αντίστροφης μεταγραφής

Στη μέθοδο δύο σταδίων, μπορούν να χρησιμοποιηθούν τρεις διαφορετικές μέθοδοι για την εκκίνηση της αντίδρασης cDNA: ολιγο(dT) εκκινητές, τυχαίοι εκκινητές ή ειδικοί για την αλληλουχία εκκινητές.Τυπικά, ολιγο(dT) εκκινητές και τυχαίοι εκκινητές χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό.Αυτοί οι εκκινητές ανόπτονται στον κλώνο mRNA του εκμαγείου και παρέχουν την αντίστροφη μεταγραφάση με ένα σημείο εκκίνησης για τη σύνθεση.

Αντίστροφη μεταγραφάση

Η αντίστροφη μεταγραφάση είναι ένα ένζυμο που χρησιμοποιεί RNA για τη σύνθεση DNA.Ορισμένες αντίστροφες μεταγραφάσες έχουν δραστηριότητα RNase και μπορούν να αποικοδομήσουν τους κλώνους RNA σε υβριδικούς κλώνους RNA-DNA μετά τη μεταγραφή.Εάν δεν έχει ενζυματική δράση RNase, μπορεί να προστεθεί RNaseH για υψηλότερη απόδοση qPCR.Τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται συνήθως περιλαμβάνουν την αντίστροφη μεταγραφάση του ιού λευχαιμίας ποντικού Moloney και την ανάστροφη μεταγραφάση του ιού του μυελοβλαστώματος των πτηνών.Για το RT-qPCR, είναι ιδανικό να επιλέξετε μια αντίστροφη μεταγραφάση με υψηλότερη θερμοσταθερότητα, έτσι ώστε η σύνθεση cDNA να μπορεί να πραγματοποιηθεί σε υψηλότερες θερμοκρασίες, διασφαλίζοντας επιτυχή μεταγραφή RNA με υψηλότερη δευτερογενή δομή, διατηρώντας παράλληλα την πλήρη δράση τους σε όλη την αντίδραση, με αποτέλεσμα υψηλότερες αποδόσεις cDNA.

Σχετικά προϊόντα:

Αντίστροφη μεταγραφάση Foreasy M-MLV

Δραστικότητα RNase H της αντίστροφης μεταγραφάσης

Το RNaseH είναι σε θέση να αποικοδομεί κλώνους RNA από διπλά RNA-DNA, επιτρέποντας την αποτελεσματική σύνθεση δίκλωνου DNA.Ωστόσο, όταν χρησιμοποιείται μακρύ mRNA ως εκμαγείο, το RNA μπορεί να αποικοδομηθεί πρόωρα, με αποτέλεσμα κολοβωμένο cDNA.Ως εκ τούτου, είναι συχνά ωφέλιμο να ελαχιστοποιείται η δραστηριότητα RNaseH κατά τη διάρκεια της κλωνοποίησης cDNA εάν είναι επιθυμητή η σύνθεση μακρών μεταγραφών.Αντίθετα, οι αντίστροφες τρανσκριπτάσες με δράση RNase H είναι συχνά ωφέλιμες για εφαρμογές qPCR επειδή ενισχύουν την τήξη των διπλών μερών RNA-DNA κατά τον πρώτο κύκλο της PCR.

Σχέδιο αστάρι

Οι εκκινητές PCR που χρησιμοποιούνται για το βήμα qPCR στο RT-qPCR θα πρέπει ιδανικά να σχεδιαστούν ώστε να εκτείνονται σε μια διασταύρωση εξονίου-εξονίου, όπου ένας εκκινητής ενίσχυσης θα μπορούσε ενδεχομένως να εκτείνεται σε ένα πραγματικό όριο εξονίου-ιντρονίου.Εφόσον οι αλληλουχίες γονιδιωματικού DNA που περιέχουν ιντρόνιο δεν ενισχύονται, αυτός ο σχεδιασμός μειώνει τον κίνδυνο ψευδώς θετικών που ενισχύονται από το μολυσμένο γονιδιωματικό DNA.

Εάν οι εκκινητές δεν μπορούν να σχεδιαστούν για να διαχωρίζουν τα όρια εξονίων ή εξονίων-εξονίων, μπορεί να είναι απαραίτητο να υποβληθούν σε επεξεργασία δειγμάτων RNA με DNase I ή dsDNase χωρίς RNase για να αφαιρεθεί η μόλυνση του γονιδιωματικού DNA.

Έλεγχος RT-qPCR

Ένας αρνητικός μάρτυρας ανάστροφης μεταγραφής (έλεγχος -RT) θα πρέπει να περιλαμβάνεται σε όλα τα πειράματα RT-qPCR για την ανίχνευση μόλυνσης DNA (όπως γονιδιωματικό DNA ή προϊόντα PCR από προηγούμενες αντιδράσεις).Αυτός ο έλεγχος περιέχει όλα τα συστατικά της αντίδρασης εκτός από την ανάστροφη μεταγραφάση.Εφόσον δεν λαμβάνει χώρα αντίστροφη μεταγραφή με αυτόν τον έλεγχο, εάν παρατηρηθεί ενίσχυση PCR, η μόλυνση από το DNA είναι πολύ πιθανή.