Η ποσοτική PCR φθορισμού (επίσης γνωστή ως TaqMan PCR, στο εξής αναφερόμενη ως FQ-PCR) είναι μια νέα ποσοτική τεχνολογία νουκλεϊκού οξέος που αναπτύχθηκε από την PE (Perkin Elmer) στις Ηνωμένες Πολιτείες το 1995. Αυτή η τεχνολογία βασίζεται στη συμβατική PCR με την προσθήκη ανιχνευτών με σήμανση φθορισμού.Σε σύγκριση με την ευέλικτη PCR, η FQ-PCR έχει πολλά πλεονεκτήματα για την πραγματοποίηση της ποσοτικής της λειτουργίας.Αυτό το άρθρο σκοπεύει να περιγράψει συνοπτικά τα χαρακτηριστικά, τις αρχές, τις μεθόδους και τις εφαρμογές της τεχνολογίας.
1 Χαρακτηριστικά
Το FQ-PCR όχι μόνο έχει την υψηλή ευαισθησία της συνηθισμένης PCR, αλλά και λόγω της εφαρμογής φθοριζόντων ανιχνευτών, μπορεί να ανιχνεύσει άμεσα την αλλαγή του σήματος φθορισμού κατά την ενίσχυση PCR μέσω του συστήματος φωτοηλεκτρικής αγωγιμότητας για τη λήψη ποσοτικών αποτελεσμάτων, το οποίο ξεπερνά πολλές ελλείψεις της συμβατικής PCR.
Για παράδειγμα, τα γενικά προϊόντα PCR πρέπει να παρατηρούνται με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης και χρώση βρωμιούχου αιθιδίου με υπεριώδες φως ή με ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου και χρώση αργύρου.Αυτό όχι μόνο απαιτεί πολλά μέσα, αλλά απαιτεί επίσης χρόνο και προσπάθεια.Οι λεκέδες που χρησιμοποιούνται Το βρωμιούχο αιθίδιο είναι επιβλαβές για το ανθρώπινο σώμα και αυτές οι πολύπλοκες πειραματικές διαδικασίες παρέχουν ευκαιρίες για ρύπανση και ψευδώς θετικά αποτελέσματα.Ωστόσο, η FQ-PCR χρειάζεται να ανοίξει το καπάκι μόνο μία φορά κατά τη φόρτωση του δείγματος και η επακόλουθη διαδικασία είναι λειτουργία εντελώς κλειστού σωλήνα, η οποία δεν απαιτεί μετα-επεξεργασία PCR, αποφεύγοντας πολλά μειονεκτήματα στις συμβατικές λειτουργίες PCR.Το πείραμα χρησιμοποιεί γενικά τον θερμικό κυκλωτή ABI7100 PCR που αναπτύχθηκε από την εταιρεία PE.
Το όργανο έχει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: ① Ευρεία εφαρμογή: Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ποσοτικοποίηση του προϊόντος PCR DNA και RNA, την έρευνα έκφρασης γονιδίων, την ανίχνευση παθογόνων και τη βελτιστοποίηση των συνθηκών PCR.② Μοναδική ποσοτική αρχή: Χρησιμοποιώντας ανιχνευτές σημασμένους με φθορισμό, η ποσότητα του φθορισμού θα συσσωρευτεί με τον κύκλο PCR μετά τη διέγερση με λέιζερ, έτσι ώστε να επιτευχθεί ο σκοπός της ποσοτικοποίησης.③ Υψηλή απόδοση εργασίας: Ενσωματωμένος θερμικός κυκλοποιητής 9600 PCR, ελεγχόμενος από υπολογιστή 1 έως 2 ώρες για να ολοκληρωθεί η ενίσχυση και η ποσοτικοποίηση 96 δειγμάτων αυτόματα και συγχρονισμένα.④ Δεν χρειάζεται ηλεκτροφόρηση γέλης: Δεν χρειάζεται να αραιώσετε και να ηλεκτροφορήσετε το δείγμα, απλώς χρησιμοποιήστε έναν ειδικό ανιχνευτή για να ανιχνεύσετε απευθείας στο σωλήνα αντίδρασης.⑤Δεν υπάρχει ρύπανση στον αγωγό: Ο μοναδικός πλήρως κλειστός σωλήνας αντίδρασης και το σύστημα φωτοηλεκτρικής αγωγιμότητας υιοθετούνται, επομένως δεν υπάρχει λόγος ανησυχίας για τη ρύπανση.⑥Τα αποτελέσματα είναι αναπαραγώγιμα: το ποσοτικό δυναμικό εύρος είναι έως και πέντε τάξεις μεγέθους.Ως εκ τούτου, δεδομένου ότι αυτή η τεχνολογία αναπτύχθηκε με επιτυχία, έχει εκτιμηθεί από πολλούς επιστημονικούς ερευνητές και έχει εφαρμοστεί σε πολλούς τομείς.
2 Αρχές και μέθοδοι
Η αρχή λειτουργίας της FQ-PCR είναι η χρήση της δραστηριότητας εξωνουκλεάσης 5'→3' του ενζύμου Taq για την προσθήκη ενός επισημασμένου με φθορισμό ανιχνευτή στο σύστημα αντίδρασης PCR.Ο ανιχνευτής μπορεί να υβριδοποιηθεί ειδικά με το εκμαγείο DNA που περιέχεται στην αλληλουχία εκκινητών.Το 5'άκρο του ανιχνευτή επισημαίνεται με το γονίδιο εκπομπής φθορισμού FAM (6-καρβοξυφθοροσκεΐνη, κορυφή εκπομπής φθορισμού στα 518 nm) και το 3' άκρο επισημαίνεται με την ομάδα σβέσης φθορισμού TAMRA (6-καρβοξυτετραμεθυλοφθορορεσκεΐνη e8-αποβολή 6-καρβοξυτετραμεθυλοροδαμίνης38, του ανιχνευτή φωσφορυλιώνεται για να αποτραπεί η επέκταση του ανιχνευτή κατά την ενίσχυση PCR.Όταν ο ανιχνευτής παραμένει άθικτος, η ομάδα απόσβεσης καταστέλλει την εκπομπή φθορισμού της ομάδας εκπομπής.Μόλις η ομάδα εκπομπής διαχωριστεί από την ομάδα σβέσης, η αναστολή αίρεται και η οπτική πυκνότητα στα 518 nm αυξάνεται και ανιχνεύεται από το σύστημα ανίχνευσης φθορισμού. Στη φάση επαναδιάταξης, ο ανιχνευτής υβριδοποιείται με το πρότυπο DNA και το ένζυμο Taq στη φάση εκκίνησης του εκμαγείου κινείται κατά μήκος της επέκτασης του εκμαγείου.Όταν ο ανιχνευτής διακόπτεται, απελευθερώνεται το φαινόμενο σβέσης και απελευθερώνεται το φθορίζον σήμα.Κάθε φορά που αντιγράφεται το πρότυπο, διακόπτεται ένας καθετήρας, συνοδευόμενος από την απελευθέρωση ενός φθορίζοντος σήματος.Δεδομένου ότι υπάρχει μια σχέση ένα προς ένα μεταξύ του αριθμού των απελευθερωμένων φθοροφόρων και του αριθμού των προϊόντων PCR, αυτή η τεχνική μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ακριβή ποσοτικοποίηση του προτύπου.Το πειραματικό όργανο χρησιμοποιεί γενικά τον θερμικό κυκλωτή ABI7100 PCR που αναπτύχθηκε από την εταιρεία PE, ενώ μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν και άλλοι θερμικοί κυκλοποιητές.Εάν για το πείραμα χρησιμοποιηθεί το σύστημα αντίδρασης τύπου αντίδρασης ABI7700, μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης, τα ποσοτικά αποτελέσματα μπορούν να δοθούν απευθείας μέσω ανάλυσης υπολογιστή.Εάν χρησιμοποιείτε άλλους θερμικούς κυκλοποιητές, πρέπει να χρησιμοποιήσετε έναν ανιχνευτή φθορισμού για τη μέτρηση του σήματος φθορισμού στον σωλήνα αντίδρασης ταυτόχρονα για τον υπολογισμό των RQ+, RQ-, △RQ.Το RQ+ αντιπροσωπεύει την αναλογία της έντασης φωταύγειας της ομάδας εκπομπής φθορισμού του σωλήνα δείγματος προς την ένταση φωταύγειας της ομάδας σβέσης, το RQ- αντιπροσωπεύει την αναλογία των δύο στον κενό σωλήνα, △RQ (△RQ=RQ+-Η ποσότητα των δεδομένων φθορισμού που αντιπροσωπεύουν τα αποτελέσματα της επεξεργασίας μετά από fluority of-) μπορούν να ληφθούν.Λόγω της εισαγωγής ανιχνευτών φθορισμού, η ειδικότητα του πειράματος βελτιώνεται σημαντικά.Ο σχεδιασμός του ανιχνευτή πρέπει γενικά να πληροί τις ακόλουθες προϋποθέσεις: ① Το μήκος του ανιχνευτή πρέπει να είναι περίπου 20-40 βάσεις για να διασφαλιστεί η ειδικότητα της δέσμευσης.②Η περιεκτικότητα των βάσεων GC είναι μεταξύ 40% και 60% για να αποφευχθεί ο διπλασιασμός των απλών νουκλεοτιδικών αλληλουχιών.③ Αποφύγετε τον υβριδισμό ή την επικάλυψη με εκκινητές.④ Η σταθερότητα της σύνδεσης μεταξύ του ανιχνευτή και του εκμαγείου είναι μεγαλύτερη από τη σταθερότητα της σύνδεσης μεταξύ του εκκινητή και του εκμαγείου, επομένως η τιμή Tm του ανιχνευτή θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 5°C υψηλότερη από την τιμή Tm του εκκινητή.Επιπλέον, η συγκέντρωση του ανιχνευτή, η ομολογία μεταξύ του ανιχνευτή και της αλληλουχίας του εκμαγείου και η απόσταση μεταξύ του ανιχνευτή και του εκκινητή έχουν όλα αντίκτυπο στα πειραματικά αποτελέσματα.
Σχετικά προϊόντα:
Κίνα Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Κατασκευαστής και Προμηθευτής |Foregene (foreivd.com)
Ώρα δημοσίευσης: Οκτ-15-2021
