Το πείραμα RT-qPCR περιλαμβάνει εκχύλιση RNA και αξιολόγηση ποιότητας, αντίστροφη μεταγραφή και qPCR τρία βήματα, κάθε βήμα έχει πολλές προφυλάξεις, θα εισαγάγουμε λεπτομερώς παρακάτω.

Ⅰ.Αξιολόγηση ποιότητας RNA

Στο πείραμα RT-qPCR, μετά την ολοκλήρωση της εκχύλισης RNA, η ποιότητα του RNA πρέπει να αξιολογηθεί και το πείραμα παρακολούθησης μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο αφού πιστοποιηθεί.Οι μέθοδοι αξιολόγησης περιλαμβάνουν φασματοφωτόμετρο, ηλεκτροφόρηση γέλης Agilent, ανάλυση Agilent 2100, μεταξύ των οποίων το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο φασματοφωτόμετρο και ανίχνευση μεθόδου ηλεκτροφόρησης γέλης αγαρόζης.Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτές οι δύο μέθοδοι πρέπει να χρησιμοποιηθούν μαζί για την ολοκλήρωση της ανίχνευσης και ανάλυσης της συγκέντρωσης, της καθαρότητας και της ακεραιότητας του RNA, ώστε να διασφαλιστεί η ποιότητα του RNA.

Σχετικό κιτ απομόνωσης RNA: 

Κιτ απομόνωσης ολικού RNA κυττάρων

Εξαιρετικά καθαρισμένο και υψηλής ποιότητας ολικό RNA μπορεί να ληφθεί από διάφορα καλλιεργημένα κύτταρα σε 11 λεπτά.

Animal Total RNA Isolation Kit

Εξάγετε γρήγορα και αποτελεσματικά ολικό RNA υψηλής καθαρότητας και υψηλής ποιότητας από διάφορους ζωικούς ιστούς.

Φασματοφωτόμετρο:

Το φασματοφωτόμετρο χρησιμοποιείται κυρίως για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης και της καθαρότητας του RNA, αλλά δεν μπορεί να ανιχνεύσει την ακεραιότητα του RNA και του γονιδιωματικού υπολείμματος.Μεταξύ αυτών, τα A260/280 και A260/230 είναι σημαντικές παράμετροι για την ανίχνευση καθαρότητας RNA και η καθαρότητα του RNA μπορεί να ανιχνευθεί ανάλογα με τις διακυμάνσεις των τιμών τους:

1. 1.9< A260/280< 2.1, που δείχνει ότι η καθαρότητα του RNA είναι καλή.A260/280<1.9, που δείχνει ότι μπορεί να υπάρχει κατάλοιπο πρωτεΐνης στο RNA.A260/280>2.1, υποδεικνύοντας πιθανή μερική αποικοδόμηση του RNA, η οποία μπορεί να επιβεβαιωθεί περαιτέρω με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης.

2. 2.0< A260/230< 2.2, που δείχνει ότι η καθαρότητα του RNA είναι καλή.A260/230< 2.0, που δείχνει ότι μπορεί να υπάρχουν υπολείμματα οργανικών αντιδραστηρίων στο RNA, όπως φαινόλες, αιθανόλη ή σάκχαρα.

Ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης:

Η δοκιμασία ηλεκτροφόρησης γέλης αγαρόζης μπορεί να αναλύσει την ακεραιότητα του RNA, το γονιδίωμα και τα υπολείμματα πρωτεΐνης, αλλά δεν μπορεί να ποσοτικοποιήσει με ακρίβεια τη συγκέντρωση του RNA ή να ανιχνεύσει τα υπολείμματα των οργανικών αντιδραστηρίων.Πάρτε για παράδειγμα πρότυπα ευκαρυωτικού RNA:

1. Το RNA υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης.Εάν υπήρχαν μόνο τρεις απλές ζώνες 28sRNA, 18sRNA και 5.8sRNA στον χάρτη της γέλης, αυτό δείχνει ότι το εξαγόμενο RNA είναι άθικτο.Εάν υπάρχει φαινόμενο έλξης, υποδηλώνει μερική αποικοδόμηση του RNA.

2. Εάν υπάρχει μία μόνο φωτεινή λωρίδα μεταξύ της οπής της κόλλας και της ζώνης 28sRNA, μπορεί να υπάρχει γονιδιωματικό υπόλειμμα DNA.

3. Εάν εμφανιστούν λωρίδες στην οπή της κόλλας, σημαίνει ότι μπορεί να υπάρχουν υπολείμματα πρωτεΐνης και άλλων μακρομοριακών ουσιών.

Ⅱ. Αντίστροφη μεταγραφή

Μετά την ολοκλήρωση της εκχύλισης RNA, πρέπει να αντιστραφεί σε cDNA για επόμενα πειράματα, επομένως το βήμα αναστροφής είναι απαραίτητο.Η αντίστροφη μεταγραφή θα εισαχθεί από την επιλογή της αντίστροφης μεταγραφάσης και του εκκινητή:

Επιλογή ανάστροφης μεταγραφάσης:

Οι τυπικές αντίστροφες μεταγραφάσες περιλαμβάνουν AMV RTase και MMLV RTase.Η RNase H της AMV RTase έχει ισχυρή δραστηριότητα, μικρό μήκος σύνθεσης, χαμηλή ποσότητα σύνθεσης και καλή θερμική σταθερότητα (42 ~ 55℃).Η δραστηριότητα RNase H της MMLV RTase είναι ασθενής, το μήκος σύνθεσης είναι μεγάλο, η ποσότητα σύνθεσης είναι υψηλή και η θερμική σταθερότητα είναι κακή (37 ~ 42℃).

Επειδή το ένζυμο RNase H έχει τη λειτουργία της αποικοδόμησης του εκμαγείου RNA, το MMLV με ασθενή δραστηριότητα RNase H θα πρέπει να επιλέγεται κατά προτίμηση κατά τη διάρκεια της αντίστροφης μεταγραφής και μετά από μεταγενέστερη γενετική μηχανική, η θερμική σταθερότητα του MMLV έχει φτάσει σε ένα ποιοτικό άλμα.Λαμβάνοντας ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV για αντίστροφη μεταγραφή) Για παράδειγμα, είναι μια νέα αντίστροφη μεταγραφάση που εκφράζεται σε βακτήρια που έχουν κατασκευαστεί από Ε. coli χρησιμοποιώντας τεχνολογία γενετικού ανασυνδυασμού.Είναι μια ανασυνδυασμένη πολυμεράση DNA που συνθέτει μια συμπληρωματική αλυσίδα DNA από μονόκλωνο RNA, DNA ή ένα υβρίδιο RNA:DNA.Δεν έχει δραστηριότητα RNase H, ισχυρή σταθερότητα, ισχυρή συγγένεια RNA και υψηλή ευαισθησία ανίχνευσης.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV για αντίστροφη μεταγραφή)

Επιλογή ασταριού:

Γενικά οι εκκινητές RT εμπίπτουν σε τρεις κατηγορίες: ολίγο dT, τυχαίους εκκινητές και ειδικούς για γονίδιο εκκινητές.Επιλέξτε κατάλληλα αστάρια για χρήση σύμφωνα με διαφορετικές πειραματικές απαιτήσεις.

1. Εάν το εκμαγείο είναι ευκαρυωτικής προέλευσης και το όψιμο cDNA χρησιμοποιείται για τη συνήθη ενίσχυση PCR, συνιστάται το Oligo (dT).Εάν το επόμενο πείραμα χρησιμοποιείται μόνο για qPCR, το Oligo (dT) συνιστάται να αναμιχθεί με τυχαίους εκκινητές για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της αντίστροφης μεταγραφής.

2. Εάν το πρότυπο προέρχεται από προκαρυωτικά, θα πρέπει να επιλεγούν τυχαίοι εκκινητές ή ειδικοί εκκινητές γονιδίου για αντίστροφη μεταγραφή.

Ⅲ.qPCR

Ο ποσοτικός προσδιορισμός φθορισμού επεξεργάζεται κυρίως από την επιλογή ποσοτικών μεθόδων, τις αρχές σχεδιασμού εκκινητών, την επιλογή ROX, τη διαμόρφωση του συστήματος αντίδρασης και τη ρύθμιση των συνθηκών αντίδρασης κ.λπ.

Επιλογή ποσοτικών μεθόδων:

Οι ποσοτικές μέθοδοι χωρίζονται σε σχετικές ποσοτικές μεθόδους και σε απόλυτες ποσοτικές μεθόδους.Η σχετική ποσοτικοποίηση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση της επίδρασης ορισμένων μεθόδων θεραπείας στη γονιδιακή έκφραση, την ανίχνευση της διαφοράς της γονιδιακής έκφρασης σε διαφορετικούς χρόνους και τη σύγκριση της διαφοράς της γονιδιακής έκφρασης σε διαφορετικούς ιστούς.Η απόλυτη ποσοτικοποίηση μπορεί να ανιχνεύσει την ποσότητα νουκλεϊκού οξέος στον ιό και ούτω καθεξής.Όταν κάνουμε πειράματα, πρέπει να επιλέγουμε τις κατάλληλες ποσοτικές μεθόδους σύμφωνα με τα δικά μας πειράματα.

Αρχές σχεδίασης ασταριού:

Ο σχεδιασμός του εκκινητή για qPCR σχετίζεται άμεσα με την αποτελεσματικότητα ενίσχυσης και την ειδικότητα του προϊόντος.Επομένως, ο σωστός σχεδιασμός καλών εκκινητών είναι το πρώτο βήμα μιας επιτυχημένης qPCR.Κατά το σχεδιασμό του ασταριού, πρέπει να ληφθούν υπόψη οι ακόλουθες αρχές κατά την τήρηση της αρχής του συμβατικού σχεδιασμού ασταριού:

1. Το μήκος του θραύσματος στόχου ελέγχεται μεταξύ 100 και 300 bp.

2. Σχεδιασμός διασταυρούμενων εξονίων για την αποφυγή της επίδρασης του γονιδιωματικού DNA.

3. Οι σχεδιασμένοι εκκινητές πρέπει να ελέγχονται για αποτελεσματικότητα ενίσχυσης και μόνο όταν η απόδοση ενίσχυσης φτάσει το πρότυπο (90-110%) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ποσοτικά πειράματα.

4. Η συγκέντρωση εκκινητών συνήθως βελτιστοποιείται μεταξύ 0,1 μΜ και 1,0 μΜ.

Επιλογή απόROX:

Στη διαδικασία της ποσοτικής αντίδρασης, το ROX μπορεί να προσαρμόσει ομοιόμορφα τη διαφορά οπτικής διαδρομής, το σφάλμα πιπέτας ή τη διαφορά όγκου που προκαλείται από την εξάτμιση και τη συμπύκνωση, βελτιώνοντας την επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων.Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι η επιλογή του ROX σχετίζεται με το όργανο.Εάν το όργανο qPCR έχει τη λειτουργία αυτόματης διόρθωσης της διαφοράς μεταξύ των οπών, δεν χρειάζεται να προσθέσει ROX.Διαφορετικά, πρέπει να προσθέσει διόρθωση ROX.Οι μικροί συνεργάτες στην αγορά αντιδραστηρίων πρέπει να είναι σύμφωνα με το όργανο που χρησιμοποιείται για την επιλογή του σωστού ROX, αποφεύγοντας τα λάθη αργότερα.

Προετοιμασία συστήματος αντίδρασης:

Προτιμώνται όγκοι αντίδρασης 20 υΐ και 50 μΙ.Κατά τη διαμόρφωση του συστήματος θα πρέπει να δοθεί προσοχή στα ακόλουθα θέματα:

1. Το σύστημα αντίδρασης πρέπει να προετοιμαστεί με αερισμό στον εξαιρετικά καθαρό πάγκο εργασίας, νέο ddH₂Το O χρησιμοποιείται για κάθε πείραμα.

2. Κάθε πείραμα πρέπει να προετοιμάσει το NTC για να επαληθεύσει εάν υπάρχει ρύπανση στο σύστημα και κάθε ζεύγος εκκινητών πρέπει να κάνει NTC κατά την προετοιμασία του συστήματος.

3. Για να ανιχνευθεί εάν υπάρχει υπόλειμμα gDNA στο εκμαγείο RNA, μπορεί να παρασκευαστεί NRT για κάθε δείγμα για ανίχνευση.

4. Κατά την προετοιμασία του συστήματος, συνιστάται να κάνετε τουλάχιστον 3 τεχνικές επαναλήψεις για ένα δείγμα.

5. Όταν το πρότυπο είναι cDNA, συνιστάται η αραίωση 5-10 φορές για να μειωθεί η επίδραση αναστολής του συστήματος αντίστροφης μεταγραφής στο πείραμα qPCR.Είναι καλύτερο να εξερευνήσετε την ποσότητα του προτύπου κατά διαβάθμιση, έτσι ώστε η τιμή CT να πέσει μεταξύ 20-30.

6. Προσδιορίστε τον απαιτούμενο αριθμό αντιδράσεων, αυξήστε κατά 5-10% με βάση τον αριθμό των αντιδράσεων και υπολογίστε τον αριθμό διαμόρφωσης όγκου.

7, το σύστημα παρασκευάζεται χρησιμοποιώντας την αρχή της προμίξης, αναμειγνύεται μετά τη φυγοκέντρηση και διασφαλίζει ότι δεν υπάρχουν φυσαλίδες.

8, στο μέτρο του δυνατού να επιλέξετε υποστηρικτικά αναλώσιμα.

Σχετικό κιτ RT-qPCR