Είναι γνωστό ότι στο κεντρικό δόγμα, το RNA είναι ο μεταγραφικός μεσολαβητής μεταξύ της έκφρασης του DNA και της πρωτεΐνης.Σε σύγκριση με την ανίχνευση του DNA, η ανίχνευση του RNA μπορεί να αντικατοπτρίζει πιο αντικειμενικά τη γονιδιακή έκφραση στους οργανισμούς.Τα πειράματα που περιλαμβάνουν RNA περιλαμβάνουν: qRT-PCR, RNA-Seq και ανίχνευση γονιδίου σύντηξης, κ.λπ. Με βάση τα χαρακτηριστικά του ίδιου του RNA (ο δακτύλιος ζάχαρης του RNA έχει μια περισσότερη ελεύθερη υδροξυλική ομάδα από τον δακτύλιο σακχάρου του DNA), σε συνδυασμό με μεγάλο αριθμό RNases στο περιβάλλον, το RNA είναι πιο ασταθές και πιο εύκολο να αποικοδομηθεί από το DNA.Σκουπίδια μέσα, σκουπίδια έξω, εάν η ποιότητα του RNA δεν είναι καλή, τότε τα πειραματικά αποτελέσματα πρέπει να είναι μη ικανοποιητικά, συγκεκριμένα να εκδηλώνονται ως ανακριβή δεδομένα ή κακή επαναληψιμότητα.Ως εκ τούτου, θα πρέπει να δοθεί μεγαλύτερη προσοχή στην επεξεργασία του RNA και η σύνδεση του ποιοτικού ελέγχου είναι επίσης πιο σημαντική για τη διασφάλιση της ακρίβειας και της ακρίβειας των επακόλουθων πειραματικών δεδομένων.

Για τον ποιοτικό έλεγχο του RNA, υπάρχουν γενικά οι ακόλουθες κοινώς χρησιμοποιούμενες μέθοδοι:

• Φασματοφωτομετρία
• ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης
• Agilent Bioanalyzer
• σε πραγματικό χρόνο φθορίζουσα ποσοτική PCR
• Μέθοδος φθορίζουσας βαφής Qubit

01 Φασματοφωτομετρία

Το RNA έχει συζευγμένους διπλούς δεσμούς και έχει κορυφή απορρόφησης σε μήκος κύματος 260 nm.Σύμφωνα με το νόμο του Lambert-Beer, μπορούμε να υπολογίσουμε τη συγκέντρωση RNA από την κορυφή απορρόφησης στα 260 nm.Επιπλέον, μπορούμε επίσης να υπολογίσουμε την καθαρότητα του RNA σύμφωνα με την αναλογία των κορυφών απορρόφησης 260nm, 280nm και 230nm.Τα 280 nm και τα 230 nm είναι οι κορυφές απορρόφησης πρωτεϊνών και μικρών μορίων, αντίστοιχα.Η αναλογία των Α260/Α280 και Α260/Α230 της ειδικής καθαρότητας RNA πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 2. Εάν είναι μικρότερη από 2, σημαίνει ότι υπάρχει μόλυνση πρωτεΐνης ή μικρού μορίου στο δείγμα RNA και πρέπει να καθαριστεί ξανά.Οι πηγές μόλυνσης θα επηρεάσουν τα κατάντη πειράματα, όπως η αναστολή της αποτελεσματικότητας ενίσχυσης των αντιδράσεων PCR, με αποτέλεσμα ανακριβή ποσοτικά αποτελέσματα.Η καθαρότητα του RNA έχει μεγάλη επίδραση στα επόμενα αποτελέσματα, επομένως η φασματοφωτομετρία είναι γενικά ένας απαραίτητος σύνδεσμος ποιοτικού ελέγχου στο πρώτο βήμα στα πειράματα νουκλεϊκού οξέος.

Εικόνα 1. Τυπικό φάσμα απορρόφησης RNA/DNA

02 Ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης

Εκτός από την καθαρότητα, η ακεραιότητα του RNA είναι επίσης ένας από τους σημαντικούς δείκτες για την κρίση της ποιότητας του RNA.Η αποικοδόμηση του RNA θα οδηγήσει σε μεγάλο αριθμό βραχέων θραυσμάτων στο δείγμα, επομένως ο αριθμός των θραυσμάτων RNA που μπορούν να ανιχνευθούν αποτελεσματικά και να καλυφθούν από την αλληλουχία αναφοράς θα μειωθεί.Η ακεραιότητα του RNA μπορεί να ελεγχθεί με ηλεκτροφόρηση ολικού RNA σε πήκτωμα αγαρόζης 1%.Αυτή η μέθοδος μπορεί να διαμορφώσετε μόνοι σας το τζελ ή να χρησιμοποιήσετε το προκατασκευασμένο σύστημα E-Gel™ για έλεγχο ακεραιότητας.Πάνω από το 80% του συνολικού RNA είναι ριβοσωμικό RNA, η πλειονότητα του οποίου αποτελείται από 28S και 18S rRNA (σε συστήματα θηλαστικών).Το RNA καλής ποιότητας θα εμφανίζει δύο εμφανείς φωτεινές ράβδους, οι οποίες είναι φωτεινές ράβδοι 28S και 18S, αντίστοιχα, στα 5 Kb και 2 Kb, και η αναλογία θα τείνει να είναι κοντά στο 2:1.Εάν είναι σε διάχυτη κατάσταση, σημαίνει ότι το δείγμα RNA μπορεί να έχει υποβαθμιστεί και συνιστάται η χρήση της μεθόδου που περιγράφεται αργότερα για περαιτέρω έλεγχο της ποιότητας του RNA.

Σχήμα 2. Σύγκριση αποικοδομημένου (λωρίδα 2) και ανέπαφου RNA (διαδρομή 3) σε ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης

03 Agilent Bioanalyzer

Εκτός από τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης γέλης αγαρόζης που περιγράφεται παραπάνω, η οποία μπορεί να μας βοηθήσει να αναγνωρίσουμε την ακεραιότητα του RNA απλά και γρήγορα, μπορούμε επίσης να χρησιμοποιήσουμε τον βιοαναλυτή Agilent για να προσδιορίσουμε την ακεραιότητα του RNA.Χρησιμοποιεί έναν συνδυασμό μικρορευστών, τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης και φθορισμού για την αξιολόγηση της συγκέντρωσης και της ακεραιότητας του RNA.Χρησιμοποιώντας τον ενσωματωμένο αλγόριθμο για την ανάλυση του προφίλ του δείγματος RNA, ο βιοαναλυτής Agilent μπορεί να υπολογίσει μια τιμή ακεραιότητας RNA αναφοράς, τον Αριθμό Ακεραιότητας RNA (στο εξής θα αναφέρεται ως RIN) [1].Όσο μεγαλύτερη είναι η τιμή του RIN, τόσο μεγαλύτερη είναι η ακεραιότητα του RNA (1 είναι εξαιρετικά υποβαθμισμένο, 10 είναι το πιο πλήρες).Ορισμένα πειράματα που περιλαμβάνουν RNA προτείνουν τη χρήση του RIN ως παραμέτρου για την αξιολόγηση της ποιότητας.Λαμβάνοντας ως παράδειγμα πειράματα προσδιορισμού αλληλουχίας υψηλής απόδοσης (εφεξής NGS), οι κατευθυντήριες γραμμές του Oncomine™ Human Immune Repertoire, το οποίο χρησιμοποιείται για την ανίχνευση υποδοχέων αντιγόνων Β κυττάρων και Τ κυττάρων στη σειρά πάνελ Oncomine του Thermo Fisher, προτείνουν ότι δείγματα με τιμές RIN μεγαλύτερες από 4, μπορούν να διαβαστούν περισσότερα αποτελεσματικά.Υπάρχουν διαφορετικά προτεινόμενα εύρη για διαφορετικούς πίνακες και συχνά ένα υψηλότερο RIN μπορεί να φέρει πιο αποτελεσματικά δεδομένα.

Εικόνα 3, σε πειράματα Oncomine™ Human Immune Repertoire, δείγματα με RIN μεγαλύτερο από 4 μπορούν να ανιχνεύσουν πιο αποτελεσματικές αναγνώσεις και κλώνους Τ κυττάρων.【2】

Ωστόσο, η τιμή RIN έχει επίσης ορισμένους περιορισμούς.Αν και το RIN έχει υψηλή συσχέτιση με την ποιότητα των πειραματικών δεδομένων NGS, δεν είναι κατάλληλο για δείγματα FFPE.Τα δείγματα FFPE έχουν υποστεί χημική επεξεργασία για μεγάλο χρονικό διάστημα και το εξαγόμενο RNA έχει γενικά μια σχετικά χαμηλή τιμή RIN.Ωστόσο, αυτό δεν σημαίνει ότι τα αποτελεσματικά δεδομένα του πειράματος δεν πρέπει να είναι ικανοποιητικά.Για να αξιολογήσουμε με ακρίβεια την ποιότητα των δειγμάτων FFPE, πρέπει να χρησιμοποιήσουμε άλλες μετρήσεις εκτός του RIN.Εκτός από το RIN, ο Agilent bioanalyzer μπορεί επίσης να υπολογίσει την τιμή DV200 ως παράμετρο αξιολόγησης της ποιότητας RNA.Το DV200 είναι μια παράμετρος που υπολογίζει την αναλογία θραυσμάτων μεγαλύτερα από 200 bp σε ένα δείγμα RNA.Το DV200 είναι καλύτερος δείκτης ποιότητας δείγματος FFPE από το RIN.Για το RNA που εξάγεται από το FFPE, έχει πολύ υψηλή συσχέτιση με τον αριθμό των γονιδίων που μπορούν να ανιχνευθούν αποτελεσματικά και την ποικιλομορφία των γονιδίων [3].Αν και το DV200 μπορεί να καλύψει τις ελλείψεις στην ανίχνευση ποιότητας του FFPE, ο βιοαναλυτής Agilent εξακολουθεί να μην μπορεί να αναλύσει πλήρως τα προβλήματα ποιότητας στα δείγματα RNA, συμπεριλαμβανομένου του εάν υπάρχουν αναστολείς στα δείγματα.Οι ίδιοι οι αναστολείς μπορούν να επηρεάσουν την αποτελεσματικότητα ενίσχυσης των μεταγενέστερων πειραμάτων και να μειώσουν τον όγκο των χρήσιμων δεδομένων.Για να γνωρίζουμε εάν υπάρχει αναστολέας στο δείγμα, μπορούμε να υιοθετήσουμε τη μέθοδο φθορισμού ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο που περιγράφεται στη συνέχεια.

04 σε πραγματικό χρόνο φθορίζουσα ποσοτική PCR

Η μέθοδος φθορισμού ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο μπορεί όχι μόνο να ανιχνεύσει τους αναστολείς στο δείγμα, αλλά και να αντικατοπτρίζει με ακρίβεια την ποιότητα του RNA στο δείγμα FFPE.Σε σύγκριση με τους βιολογικούς αναλυτές Agilent, τα ποσοτικά όργανα φθορισμού σε πραγματικό χρόνο είναι πιο δημοφιλή στα μεγάλα βιολογικά εργαστήρια λόγω της ευρύτερης εφαρμογής τους.Για να ελέγξουμε την ποιότητα των δειγμάτων RNA, χρειάζεται μόνο να αγοράσουμε ή να προετοιμάσουμε ανιχνευτές εκκινητών για εσωτερικά γονίδια αναφοράς, όπως το GUSB (Cat αρ. Hs00939627).Χρησιμοποιώντας αυτό το σύνολο εκκινητών, ανιχνευτών και προτύπων (ολικό RNA γνωστής συγκέντρωσης) για τη διεξαγωγή απόλυτων ποσοτικών πειραμάτων, η αποτελεσματική συγκέντρωση θραύσματος RNA μπορεί να υπολογιστεί ως το πρότυπο αξιολόγησης της ποιότητας RNA (συντομία Functional RNA Quantitation (FRQ)).Σε μια δοκιμή NGS, διαπιστώσαμε ότι το FRQ των δειγμάτων RNA έχει πολύ υψηλή συσχέτιση με τον αποτελεσματικό όγκο δεδομένων.Για όλα τα δείγματα μεγαλύτερα από 0,2 ng/uL FRQ, τουλάχιστον το 70% των αναγνώσεων μπορεί να καλύψει αποτελεσματικά την ακολουθία αναφοράς (Εικόνα 4).

Σχήμα 4, η τιμή FRQ που ανιχνεύθηκε με την ποσοτική μέθοδο φθορισμού έχει πολύ υψηλή συσχέτιση (R2>0,9) με τα αποτελεσματικά δεδομένα που ελήφθησαν στο πείραμα NGS.Η κόκκινη γραμμή είναι η τιμή FRQ ίση με 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Εκτός από το ότι μπορεί να εφαρμοστεί σε δείγματα FFPE, η μέθοδος ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο μπορεί επίσης να παρακολουθεί αποτελεσματικά τους αναστολείς στα δείγματα.Μπορούμε να προσθέσουμε το προς ανίχνευση δείγμα στο σύστημα αντίδρασης με τον Εσωτερικό Θετικό Έλεγχο (IPC) και τον προσδιορισμό του και στη συνέχεια να πραγματοποιήσουμε ποσοτικοποίηση φθορισμού για να λάβουμε την τιμή Ct.Εάν η τιμή Ct υστερεί σε σχέση με την τιμή Ct στην αντίδραση χωρίς δείγμα, υποδηλώνει ότι ο αναστολέας είναι παρών στο δείγμα και αναστέλλει την αποτελεσματικότητα ενίσχυσης στην αντίδραση.

05 Μέθοδος φθορίζουσας βαφής Qubit

Το φθορόμετρο Qubit είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μικρή συσκευή για την ανίχνευση συγκέντρωσης και καθαρότητας νουκλεϊκών οξέων, η οποία είναι εύκολη στη λειτουργία και υπάρχει σχεδόν σε κάθε εργαστήριο μοριακής βιολογίας.Υπολογίζει με ακρίβεια τη συγκέντρωση νουκλεϊκού οξέος με ανίχνευση και φθορίζουσα βαφή που δεσμεύει το νουκλεϊκό οξύ (αντιδραστήριο ανίχνευσης Qubit).Το Qubit έχει υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα και μπορεί να ποσοτικοποιήσει με ακρίβεια το RNA έως τη συγκέντρωση pg/μL.Εκτός από τη γνωστή ικανότητα να ποσοτικοποιείται με ακρίβεια η συγκέντρωση νουκλεϊκού οξέος, το τελευταίο νέο μοντέλο της Thermo Fisher, Qubit 4.0, μπορεί επίσης να ανιχνεύσει την ακεραιότητα του RNA.Το σύστημα ανίχνευσης RNA του Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) ανιχνεύει την ακεραιότητα του RNA ανιχνεύοντας ταυτόχρονα δύο συγκεκριμένες φθορίζουσες χρωστικές.Αυτές οι δύο φθορίζουσες βαφές μπορούν να συνδεθούν με μεγάλα θραύσματα και μικρά θραύσματα RNA, αντίστοιχα.Αυτές οι δύο φθορίζουσες βαφές υποδεικνύουν την αναλογία μεγάλων θραυσμάτων RNA στο δείγμα και από αυτήν μπορεί να υπολογιστεί η τιμή IQ (Integrity and Quality) που αντιπροσωπεύει την ποιότητα RNA.Η τιμή IQ εφαρμόζεται τόσο σε δείγματα FFPE όσο και σε δείγματα μη FFPE και έχει μεγάλη επίδραση στην επακόλουθη ποιότητα αλληλουχίας.Λαμβάνοντας ως παράδειγμα τα πειράματα NGS, στα πειράματα δοκιμής RNA-Seq που πραγματοποιήθηκαν στην πλατφόρμα Ion torrent™, τα περισσότερα δείγματα με τιμές IQ μεγαλύτερες από 4 είχαν τουλάχιστον 50% αποτελεσματικές αναγνώσεις (Εικόνα 5).Σε σύγκριση με τις προαναφερθείσες μεθόδους ανίχνευσης, το Qubit IQ Assay όχι μόνο είναι πιο βολικό στη λειτουργία και απαιτεί λιγότερο χρόνο (μέσα σε πέντε λεπτά), αλλά έχει επίσης μεγάλη συσχέτιση μεταξύ της τιμής IQ της μετρούμενης παραμέτρου και της ποιότητας δεδομένων των μεταγενέστερων πειραμάτων.

Σχήμα 5, υπάρχει μεγάλη συσχέτιση μεταξύ της τιμής Qubit RNA IQ και των χαρτογραφημένων αναγνώσεων του RNA-Seq.【5】

Μέσα από την παραπάνω εισαγωγή, πιστεύω ότι όλοι έχουν επαρκή κατανόηση των διαφορετικών μεθόδων ελέγχου ποιότητας RNA.Στην πράξη, μπορείτε να επιλέξετετην αντίστοιχη μέθοδο σύμφωνα με τον τύπο του δείγματος και τα υπάρχοντα όργανα.Μόνο ελέγχοντας καλά την ποιότητα του RNA μπορούμε να αποφύγουμε την αποτυχία μεταγενέστερων πειραμάτων που προκαλούνται από κακή ποιότητα δείγματος, εξοικονομώντας έτσι πολύτιμο χρόνο, ενέργεια και κόστος.

Προϊόντα αναφοράς:

Animal Total RNA Isolation Kit

Κιτ απομόνωσης ολικού RNA κυττάρων

βιβλιογραφικές αναφορές

【1】 Schroeder, Α., Mueller, Ο., Stocker, S. et al.Το RIN: ένας αριθμός ακεραιότητας RNA για την εκχώρηση τιμών ακεραιότητας σε μετρήσεις RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Οδηγός χρήστη Oncomine Human Immune Repertoire (Αρ. έκδοσης MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Produced From Archival Formalin Fixed Paraffin-Embedded Samples, Auguste 29, Τοξικολογικές Επιστήμες17, Τοξικολογικές Επιστήμες17, 57–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/