Αποστείρωση άκρων πιπέτας και σωλήνων EP κ.λπ.
1. Προετοιμάστε 0,1% (ένα χιλιοστό) DEPC (υψηλά τοξική ουσία) με απιονισμένο νερό, χρησιμοποιήστε το προσεκτικά σε απαγωγέα καπνού και αποθηκεύστε το στους 4°C μακριά από το φως.
Το νερό DEPC είναι καθαρό νερό επεξεργασμένο με DEPC και αποστειρωμένο με υψηλή θερμοκρασία και υψηλή πίεση.Δοκιμάστηκε για να είναι απαλλαγμένο από RNase, DNase και πρωτεϊνάση.
2. Τοποθετήστε το άκρο της πιπέτας και το σωλήνα EP σε 0,1% DEPC και βεβαιωθείτε ότι το άκρο της πιπέτας και ο σωλήνας EP έχουν γεμίσει με 0,1% DEP.
3. Προστατέψτε από το φως, αφήστε το να σταθεί όλη τη νύχτα (12-24 ώρες)
4. Το κουτί που περιέχει το άκρο και το σωλήνα EP δεν χρειάζεται να εμποτιστεί με DEPC.Αφού αφαιρέσετε χονδρικά το νερό DEPC στο άκρο ή στο σωλήνα EP, συσκευάστε το και τυλίξτε το.
5. 121 βαθμοί Κελσίου, 30min
6. 180 βαθμοί Κελσίου, στεγνώστε για αρκετές ώρες (τουλάχιστον 3 ώρες)
Σημείωση: α.Φοράτε γάντια και μάσκες από λάτεξ όταν χειρίζεστε το DEPC!β, ή χωρίς αποστείρωση DEPC, 130 ℃, 90 λεπτά αυτόκλειστο (πολλά εργαστήρια αποστείρωση υψηλής θερμοκρασίας δύο φορές)
Θέματα εξαγωγής RNA
Δύο κύρια φαινόμενα αποτυχίας απομόνωσης ιστικού RNA
Αποικοδόμηση RNA και υπολείμματα ακαθαρσιών στους ιστούς,Όσον αφορά την αποικοδόμηση, ας δούμε πρώτα γιατί το RNA που εξάγεται από τα καλλιεργημένα κύτταρα δεν αποικοδομείται εύκολα.Τα υπάρχοντα αντιδραστήρια εκχύλισης RNA περιέχουν όλα συστατικά που αναστέλλουν γρήγορα την RNase.Προσθέστε το προϊόν λύσης στα καλλιεργημένα κύτταρα και απλώς ανακατέψτε το, όλα τα κύτταρα μπορούν να αναμειχθούν πλήρως με το προϊόν λύσης και τα κύτταρα λύονται πλήρως.Μετά τη λύση των κυττάρων, τα ενεργά συστατικά του λύματος αναστέλλουν αμέσως την ενδοκυτταρική RNase, έτσι το RNA παραμένει ανέπαφο.Δηλαδή, επειδή τα καλλιεργημένα κύτταρα έρχονται σε επαφή εύκολα και πλήρως με το προϊόν λύσης, το RNA τους δεν αποικοδομείται εύκολα.Από την άλλη πλευρά, το RNA στον ιστό αποικοδομείται εύκολα επειδή τα κύτταρα στον ιστό δεν είναι εύκολο να έρθουν σε επαφή γρήγορα με το προϊόν λύσης.λόγω επαρκούς επαφής.Ετσι,Υποθέτοντας ότι υπάρχει τρόπος να μετατραπεί ο ιστός σε ένα μόνο κύτταρο ενώ αναστέλλεται η δραστηριότητα του RNA, το πρόβλημα της αποδόμησης θα μπορούσε να λυθεί πλήρως.
Η άλεση με υγρό άζωτο είναι η πιο αποτελεσματική τέτοια μέθοδος.Ωστόσο, η μέθοδος άλεσης με υγρό άζωτο είναι πολύ ενοχλητική, ειδικά όταν ο αριθμός των δειγμάτων είναι μεγάλος.Αυτό προκάλεσε το επόμενο καλύτερο πράγμα: τον ομογενοποιητή.οομογενοποιητήςΗ μέθοδος δεν εξετάζει το ερώτημα πώς αναστέλλεται η δραστηριότητα RNase πριν τα κύτταρα έρθουν σε επαφή με το προϊόν λύσης, αλλά μάλλον προσεύχεται ώστε ο ρυθμός διάσπασης του ιστού να είναι ταχύτερος από τον ρυθμό με τον οποίο η ενδοκυτταρική RNase αποικοδομεί το RN.
Η επίδραση του ηλεκτρικού ομογενοποιητή είναι καλύτερη,και η επίδραση του ομογενοποιητή γυαλιού είναι κακή, αλλά γενικά, η μέθοδος ομογενοποιητή δεν μπορεί να αποτρέψει το φαινόμενο της υποβάθμισης.Επομένως, εάν η εκχύλιση υποβαθμιστεί, θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί ο αρχικός ηλεκτρικός ομογενοποιητής για άλεση με υγρό άζωτο.ο αρχικός ομογενοποιητής γυαλιού πρέπει να αλλάξει σε ηλεκτρικό ομογενοποιητή ή να αλεσθεί απευθείας με υγρό άζωτο.Το πρόβλημα είναι σχεδόν 100% εφικτό.λυθεί.
Το πρόβλημα των υπολειμμάτων ακαθαρσίας που επηρεάζει τα επόμενα πειράματα έχει περισσότερες διαφορετικές αιτίες από την υποβάθμιση και οι λύσεις είναι αντίστοιχα διαφορετικές.Συμπερασματικά,Εάν υπάρχει αποικοδόμηση ή υπολειμματικές ακαθαρσίες στον ιστό, η μέθοδος/αντιδραστήριο εκχύλισης για το συγκεκριμένο πειραματικό υλικό πρέπει να βελτιστοποιηθεί.Δεν χρειάζεται να χρησιμοποιήσετε τα πολύτιμα δείγματά σας για βελτιστοποίηση: μπορείτε να αγοράσετε μερικά μικρά ζώα όπως ψάρι/κοτόπουλο από την αγορά, να πάρετε το αντίστοιχο μέρος του υλικού για την εξαγωγή RNA και το άλλο μέρος για την εκχύλιση πρωτεΐνης – να αλέσετε με εκχύλισμα στόματος, στομάχου και εντέρων.
Το RNA στόχος του εξαγόμενου RNA χρησιμοποιείται για διαφορετικά πειράματα παρακολούθησης και οι απαιτήσεις ποιότητας του είναι διαφορετικές
Η κατασκευή βιβλιοθήκης cDNA απαιτεί ακεραιότητα RNA χωρίς υπολείμματα αναστολέων ενζυμικής αντίδρασης.Η Northern απαιτεί υψηλότερη ακεραιότητα RNA και χαμηλότερες απαιτήσεις για υπολείμματα αναστολέων ενζυμικής αντίδρασης.Η RT-PCR δεν απαιτεί πολύ υψηλή ακεραιότητα RNA,αλλά αναστέλλει τις ενζυμικές αντιδράσεις.Οι απαιτήσεις για τα κατάλοιπα είναι αυστηρές.Η είσοδος καθορίζει την έξοδο.κάθε φορά που ο στόχος είναι να ληφθεί το RNA υψηλότερης καθαρότητας, θα κοστίζει στους ανθρώπους και χρήματα.
Συλλογή/Αποθήκευση δειγμάτων
Παράγοντες που επηρεάζουν την αποικοδόμηση Αφού το δείγμα εγκαταλείψει το ζωντανό σώμα/ή το αρχικό περιβάλλον ανάπτυξης, τα ενδογενή ένζυμα στο δείγμα θα αρχίσουν να αποδομούν το RNA,και ο ρυθμός αποικοδόμησης σχετίζεται με την περιεκτικότητα σε ενδογενή ένζυμα και τη θερμοκρασία.Παραδοσιακά, υπάρχουν μόνο δύο τρόποι για την πλήρη αναστολή της ενδογενούς ενζυμικής δραστηριότητας: προσθέστε αμέσως το προϊόν λύσης και ομογενοποιήστε πλήρως και γρήγορα.κόβουμε σε μικρά κομμάτια και παγώνουμε αμέσως σε υγρό άζωτο.Και οι δύο προσεγγίσεις απαιτούν γρήγορη λειτουργία.Το τελευταίο είναι κατάλληλο για όλα τα δείγματα, ενώ το πρώτο είναι κατάλληλο μόνο για ιστούς με χαμηλή περιεκτικότητα σε κύτταρα και ενδογενή ένζυμα και ευκολότερη ομογενοποίηση.Συγκεκριμένα, ο φυτικός ιστός, το συκώτι, ο θύμος, το πάγκρεας, ο σπλήνας, ο εγκέφαλος, το λίπος, ο μυϊκός ιστός κ.λπ. καταψύχονται καλύτερα με υγρό άζωτο πριν προχωρήσουμε.
Κατακερματισμός και ομογενοποίηση δειγμάτων
Παράγοντες που επηρεάζουν την υποβάθμιση και την απόδοση Ο κατακερματισμός του δείγματος είναιγια πλήρη ομογενοποίηση, που είναι για πλήρη και πλήρη απελευθέρωση RNA.Τα κύτταρα μπορούν να ομογενοποιηθούν απευθείας χωρίς να σπάσουν.Οι ιστοί μπορούν να ομογενοποιηθούν μόνο αφού σπάσουν.Η ζύμη και τα βακτήρια πρέπει να σπάσουν με αντίστοιχα ένζυμα προτού μπορέσουν να ομογενοποιηθούν.Οι ιστοί με χαμηλότερη περιεκτικότητα σε ενδογενή ένζυμα και ευκολότερη ομογενοποίηση μπορούν να συνθλίβονται και να ομογενοποιούνται ταυτόχρονα στο προϊόν λύσης με ομογενοποιητή.φυτικός ιστός, ήπαρ, θύμος, πάγκρεας, σπλήνα, εγκέφαλος, λίπος, μυϊκός ιστός και άλλα δείγματα, είτε έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε ενδογενή ένζυμα είτε δεν ομογενοποιούνται εύκολα,οπότε η διάσπαση και η ομογενοποίηση των ιστών πρέπει να γίνονται χωριστά.Η πιο αξιόπιστη και πιο παραγωγική μέθοδος θρυμματισμού είναι η άλεση με υγρό άζωτο και η πιο αξιόπιστη μέθοδος ομογενοποίησης είναι η χρήση ηλεκτρικού ομογενοποιητή.Μια ειδική σημείωση για την άλεση με υγρό άζωτο: το δείγμα δεν πρέπει να αποψυχθεί καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας άλεσης, καθώς τα ενδογενή ένζυμα είναι πιο πιθανό να λειτουργήσουν όταν καταψύχονται.
Επιλογή λύματος
Επηρεάζοντας την ευκολία λειτουργίας και τους παράγοντες των υπολειμματικών ενδογενών προσμίξεων Τα κοινώς χρησιμοποιούμενα διαλύματα λύσης μπορούν σχεδόν να αναστείλουν τη δραστηριότητα της RNase.Επομένως, το βασικό σημείο επιλογής ενός διαλύματος λύσης είναι να ληφθεί υπόψη σε συνδυασμό με τη μέθοδο καθαρισμού.Υπάρχει μία εξαίρεση:Σε δείγματα με υψηλή περιεκτικότητα σε ενδογενή ένζυμα συνιστάται η χρήση λύματος που περιέχει φαινόλη για να αυξηθεί η ικανότητα αδρανοποίησης ενδογενών ενζύμων.
Επιλογή μεθόδου καθαρισμού
Παράγοντες που επηρεάζουν τις υπολειμματικές ενδογενείς ακαθαρσίες, ταχύτητα εκχύλισης Για καθαρά δείγματα όπως τα κύτταρα, μπορούν να ληφθούν ικανοποιητικά αποτελέσματα με σχεδόν οποιαδήποτε μέθοδο καθαρισμού διαθέσιμη.Αλλά για πολλά άλλα δείγματα, ειδικά εκείνα με υψηλά επίπεδα ακαθαρσιών, όπως φυτά, συκώτι, βακτήρια κ.λπ., η επιλογή μιας κατάλληλης μεθόδου καθαρισμού είναι καθοριστική.Η μέθοδος φυγόκεντρου καθαρισμού στήλης έχει γρήγορη ταχύτητα εκχύλισης και μπορεί να αφαιρέσει αποτελεσματικά τις ακαθαρσίες που επηρεάζουν την επακόλουθη ενζυματική αντίδραση του RNA, αλλά είναι ακριβή (Η Foregene μπορεί να προσφέρει οικονομικά αποδοτικά κιτ, περισσότερες λεπτομέρειες κάντε κλικεδώ)Η χρήση οικονομικών και κλασικών μεθόδων καθαρισμού, όπως η κατακρήμνιση LiCl, μπορεί επίσης να επιτύχει ικανοποιητικά αποτελέσματα, αλλά ο χρόνος λειτουργίας είναι μεγάλος..
«Τρεις πειθαρχίες και οκτώ προσοχές» για την εξαγωγή RNA
Πειθαρχία 1:Βάλτε ένα τέλος στη μόλυνση των εξωγενών ενζύμων.
Σημείωση 1:Φοράτε αυστηρά μάσκες και γάντια.
Σημείωση 2:Οι σωλήνες φυγοκέντρησης, οι κεφαλές αιχμής, οι ράβδοι πιπέτας, οι δεξαμενές ηλεκτροφόρησης και οι πειραματικοί πάγκοι που συμμετέχουν στο πείραμα θα πρέπει να απορριφθούν σχολαστικά.
Σημείωση 3:Τα αντιδραστήρια/διαλύματα που εμπλέκονται στο πείραμα, ιδιαίτερα το νερό, πρέπει να είναι απαλλαγμένα από RNase.
Πειθαρχία 2:Αποκλείστε τη δραστηριότητα των ενδογενών ενζύμων
Σημείωση 4:Επιλέξτε την κατάλληλη μέθοδο ομογενοποίησης.
Σημείωση 5:Επιλέξτε ένα κατάλληλο λύμα.
Σημείωση 6:Ελέγξτε την αρχική ποσότητα του δείγματος.
Πειθαρχία 3:Διευκρινίστε τον σκοπό εξαγωγής σας
Σημείωση 7:Με οποιοδήποτε σύστημα λύματος πλησιάζει τη μέγιστη αρχική ποσότητα δείγματος, το ποσοστό επιτυχίας της εκχύλισης μειώνεται απότομα.
Σημείωση 8:Το μόνο οικονομικό κριτήριο για την επιτυχή εκχύλιση RNA είναι η επιτυχία στα επόμενα πειράματα και όχι η απόδοση.
Κορυφαίες 10 πηγές μόλυνσης από RNase
1. Τα δάχτυλα είναι η πρώτη πηγή εξωγενών ενζύμων, επομένως τα γάντια πρέπει να φοριούνται και να αντικαθίστανται συχνά.Επιπλέον, πρέπει να φορεθούν και μάσκες, γιατί η αναπνοή είναι επίσης σημαντική πηγή ενζύμων.Ένα επιπλέον όφελος από τη χρήση μάσκας γαντιών είναι η προστασία του πειραματιστή.
2. Ρύγχη πιπέττας, σωλήνες φυγοκέντρησης, σιφώνια – Η RNase δεν μπορεί να απενεργοποιηθεί μόνο με αποστείρωση, επομένως τα άκρα πιπέτας και οι σωλήνες φυγοκέντρησης θα πρέπει να υποβάλλονται σε επεξεργασία με DEPC, ακόμη και αν επισημαίνονται ως κατεργασμένα με DEPC.Είναι καλύτερο να χρησιμοποιήσετε μια πιπέτα ειδικής χρήσης, σκουπίστε την με ένα βαμβάκι 75% αλκοόλ πριν τη χρήση, ειδικά τη ράβδο.Επιπλέον, βεβαιωθείτε ότι δεν χρησιμοποιείτε αφαίρεση κεφαλής.
3. Το νερό/ρυθμιστικό διάλυμα πρέπει να είναι απαλλαγμένο από μόλυνση RNase.
4. Τουλάχιστον το τραπέζι δοκιμών θα πρέπει να καθαρίζεται με μπάλες βαμβακιού 75% οινόπνευμα.
5.Ενδογενής RNase Όλοι οι ιστοί περιέχουν ενδογενή ένζυμα, επομένως η γρήγορη κατάψυξη των ιστών με υγρό άζωτο είναι ο καλύτερος τρόπος για τη μείωση της αποικοδόμησης.Η μέθοδος αποθήκευσης/άλεσης υγρού αζώτου είναι πράγματι άβολη, αλλά είναι ο μόνος τρόπος για ιστούς με υψηλά επίπεδα ενδογενών ενζύμων.
6. Δείγματα RNA Τα προϊόντα εξαγωγής RNA ενδέχεται να περιέχουν ίχνη μόλυνσης από RNase.
7. Εκχύλιση πλασμιδίου Η εκχύλιση πλασμιδίου χρησιμοποιεί συχνά Rnase για την αποικοδόμηση του RNA και η υπολειπόμενη Rnase πρέπει να χωνεύεται με Πρωτεϊνάση Κ και να εκχυλίζεται με PCI.
8. Αποθήκευση RNA Ακόμη και αν αποθηκευτεί σε χαμηλή θερμοκρασία, ίχνη RNase θα προκαλέσουν αποικοδόμηση του RNA.Η καλύτερη λύση για μακροχρόνια διατήρηση του RNA είναι ένα εναιώρημα άλατος/αλκοόλης, επειδή το αλκοόλ αναστέλλει κάθε ενζυματική δραστηριότητα σε χαμηλές θερμοκρασίες.
9. Όταν τα κατιόντα (Ca, Mg) περιέχουν αυτά τα ιόντα, η θέρμανση στους 80 C για 5 λεπτά θα προκαλέσει τη διάσπαση του RNA, επομένως εάν το RNA πρέπει να θερμανθεί, το διάλυμα συντήρησης πρέπει να περιέχει έναν χηλικό παράγοντα (1 mM Κιτρικό νάτριο, pH 6,4).
10. Ένζυμα που χρησιμοποιούνται σε επόμενα πειράματα μπορεί να μολυνθούν από RNase.
10 Συμβουλές για την εξαγωγή RNA
1: Αποτρέψτε γρήγορα τη δραστηριότητα RNase.Τα δείγματα καταψύχονται γρήγορα μετά τη συλλογή και η RNase απενεργοποιείται με ταχεία λειτουργία κατά τη διάρκεια της λύσης.
2: Επιλέξτε μια κατάλληλη μέθοδο εκχύλισης για ιστό με υψηλή περιεκτικότητα σε ριβοένζυμα και ο λιπώδης ιστός είναι καλύτερο να χρησιμοποιήσετε τη μέθοδο που περιέχει φαινόλη.
3: Η ποιότητα πρόβλεψης απαιτεί Northern, η κατασκευή βιβλιοθήκης cDNA απαιτεί υψηλή ακεραιότητα και η RT-PCR και η RPA (δοκιμή προστασίας ριβονουκλεάσης) δεν απαιτούν υψηλή ακεραιότητα.Η RT-PCR απαιτεί υψηλή καθαρότητα (υπολείμματα αναστολέα ενζύμου).
4: Η πλήρης ομογενοποίηση είναι το κλειδί για τη βελτίωση της απόδοσης και τη μείωση της υποβάθμισης.
5: Ελέγξτε την ακεραιότητα της ανίχνευσης ηλεκτροφόρησης RNA, 28S: 18S = 2: 1 είναι πλήρες σημάδι, 1: 1 είναι επίσης αποδεκτό για τα περισσότερα πειράματα.
6: Αφαίρεση DNA για RT-PCR, ανάλυση συστοιχίας Είναι καλύτερο να χρησιμοποιήσετε το Dnase I για την αφαίρεση του DNA.
7: Μειώστε τη μόλυνση των εξωγενών ενζύμων – τα ένζυμα δεν μπορούν να εισαχθούν από το εξωτερικό.
8: Κατά τη συμπύκνωση νουκλεϊκού οξέος χαμηλής συγκέντρωσης, θα πρέπει να προστεθεί ένα αντιδραστήριο συν-καθίζησης.Αλλά για να αποτραπεί η μόλυνση που περιέχει ένζυμα και DNA που περιέχει ταυτόχρονα.
9: Διαλύστε καλά το RNA, εάν χρειάζεται, θερμαίνετε στους 65 C για 5 λεπτά.
κατάλληλη μέθοδο αποθήκευσης
Μπορεί να αποθηκευτεί στους –20C για μικρό χρονικό διάστημα και στους –80C για μεγάλο χρονικό διάστημα.Το πρώτο βήμα για τη βελτίωση των αποδόσεων RNA είναι να συνειδητοποιήσουμε ότι η περιεκτικότητα σε RNA διαφορετικών δειγμάτων ποικίλλει πολύ.Υψηλή αφθονία (2-4 μg/mg) όπως συκώτι, πάγκρεας, καρδιά, μέτρια αφθονία (0,05-2 μg/mg) όπως εγκέφαλος, έμβρυο, νεφρός, πνεύμονας, θύμος, ωοθήκη, χαμηλή αφθονία (<0,05 μg/mg) mg) όπως κύστη, οστά, λίπος.
1: Λύση των κυττάρων για την απελευθέρωση RN – εάν το RNA δεν απελευθερωθεί, η απόδοση θα μειωθεί.Η ηλεκτρική ομογενοποίηση λειτουργεί καλύτερα από άλλες μεθόδους ομογενοποίησης, αλλά μπορεί επίσης να χρειαστεί να συνδυαστεί με άλλες μεθόδους, όπως πολτοποίηση υγρού αζώτου, ενζυματική πέψη (Lysozyme/Lyticase)
2: Βελτιστοποίηση της μεθόδου εξαγωγής.Τα μεγαλύτερα προβλήματα με τις μεθόδους που βασίζονται στη φαινόλη είναι η ατελής στρωματοποίηση και η μερική απώλεια RNA (το υπερκείμενο δεν μπορεί να αφαιρεθεί πλήρως).Η ατελής στρωματοποίηση οφείλεται στην υψηλή περιεκτικότητα σε νουκλεϊκό οξύ και πρωτεΐνη, η οποία μπορεί να επιλυθεί αυξάνοντας την ποσότητα του χρησιμοποιούμενου προϊόντος λύσης ή μειώνοντας την ποσότητα του δείγματος.Ένα στάδιο εκχύλισης χλωροφορμίου προστέθηκε στον λιπώδη ιστό.Η απώλεια RNA μπορεί να μειωθεί με αντίστροφη άντληση ή με αφαίρεση της οργανικής στιβάδας που ακολουθείται από φυγοκέντρηση.Το μεγαλύτερο πρόβλημα με τις μεθόδους που βασίζονται στη φυγοκέντρηση στήλης είναι η περίσσεια δείγματος.
Κλασικές συμβουλές εξαγωγής
1. Καθαρισμός με φαινόλη: Προσθέστε ίσο όγκο φαινόλης/χλωροφόρμιου 1:1 και ανακατέψτε ζωηρά για 1-2 λεπτά.Φυγοκεντρήστε σε υψηλή ταχύτητα για 2 λεπτά.Αφαιρέστε προσεκτικά το υπερκείμενο (80-90%).Μην φτάσετε ποτέ στο μεσαίο στρώμα.Ένας ίσος όγκος του διαλύματος της αντίδρασης μπορεί να προστεθεί σε Φαινόλη/Χλωροφόρμιο και το υπερκείμενο να αφαιρεθεί.Τα δύο υπερκείμενα μπορούν να αναμειχθούν μαζί για καθίζηση νουκλεϊκού οξέος για βελτίωση της απόδοσης.Μην είστε πολύ ήπιοι κατά την ανάμειξη και μην προσπαθήσετε να αφαιρέσετε όλο το υπερκείμενο.
2. Πλύσιμο με αιθανόλη 70-80%.Ταυτόχρονα, αμέσως μετά την έκχυση της αιθανόλης, φυγοκεντρήστε σε υψηλή ταχύτητα για μερικά δευτερόλεπτα και στη συνέχεια αφαιρέστε την υπολειμματική αιθανόλη με μια πιπέτα.Διαλύεται αφού παραμείνει σε θερμοκρασία δωματίου για 5-10 λεπτά.
11. Εξαγωγή ειδικών οργανισμών
1. Ινώδης ιστός: Το κλειδί για την εξαγωγή RNA από ινώδη ιστό όπως η καρδιά/σκελετικός μυς είναι η πλήρης διάσπαση του ιστού.Αυτοί οι ιστοί έχουν χαμηλή κυτταρική πυκνότητα, επομένως η ποσότητα RNA ανά μονάδα βάρους ιστού είναι χαμηλή και είναι καλύτερο να χρησιμοποιείται όσο το δυνατόν περισσότερη αρχική ποσότητα.Φροντίστε να τρίψετε τον ιστό σχολαστικά κάτω από συνθήκες κατάψυξης.
2. Ιστοί με υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες/λίπος: η περιεκτικότητα του εγκεφάλου/φυτικού λίπους είναι υψηλή.Μετά την εκχύλιση PCI, το υπερκείμενο περιέχει λευκά κροκίδια.Το υπερκείμενο πρέπει να εκχυλιστεί εκ νέου με χλωροφόρμιο.
3. Ιστοί με υψηλή περιεκτικότητα σε νουκλεϊκό οξύ/ριβοένζυμα: ο σπλήνας/θύμος έχει υψηλή περιεκτικότητα σε νουκλεϊκό οξύ και ριβοένζυμο.Η λείανση του ιστού υπό συνθήκες κατάψυξης που ακολουθείται από ταχεία ομογενοποίηση μπορεί να απενεργοποιήσει αποτελεσματικά τα ριβοένζυμα.Ωστόσο, εάν το προϊόν λύσης είναι πολύ παχύρρευστο (λόγω της υψηλής περιεκτικότητας σε νουκλεϊκό οξύ), η εκχύλιση PCI δεν θα είναι σε θέση να στρωματοποιηθεί αποτελεσματικά.Η προσθήκη περισσότερων λυμάτων μπορεί να επιλύσει αυτό το ζήτημα.Πολλαπλές εξαγωγές PCI μπορούν να αφαιρέσουν περισσότερο υπολειμματικό DNA.Εάν σχηματιστεί λευκό ίζημα αμέσως μετά την προσθήκη αλκοόλης, υποδηλώνει μόλυνση του DNA.Η επανεκχύλιση με όξινο PCI μετά τη διάλυση μπορεί να αφαιρέσει τη μόλυνση του DNA.
4. Φυτικός ιστός: Ο φυτικός ιστός είναι πιο περίπλοκος από τον ζωικό ιστό.Γενικά, τα φυτά αλέθονται υπό συνθήκες υγρού αζώτου, επομένως η αποικοδόμηση του RNA από ενδογενή ένζυμα είναι ασυνήθιστη.Εάν το πρόβλημα αποικοδόμησης δεν επιλυθεί, είναι σχεδόν βέβαιο ότι προκαλείται από ακαθαρσίες που περιέχονται στο δείγμα.Οι ακαθαρσίες που περιέχονται σε πολλά φυτά θα οδηγήσουν σε υπολείμματα, και ο λόγος για τα υπολείμματα είναι συχνά επειδή αυτές οι ακαθαρσίες έχουν κάποιες ομοιότητες με το RNA: κατακρημνίζετε και κατακρημνίζομαι, και προσροφείτε και προσροφώ.Αυτά τα χαρακτηριστικά καθορίζουν ότι είναι πολύ ισχυροί αναστολείς ενζύμων.
Επί του παρόντος, τα εμπορικά αντιδραστήρια εκχύλισης RNA μπορούν να προσαρμοστούν σε όλους σχεδόν τους ζωικούς ιστούς με μικρές προσαρμογές, αλλά υπάρχουν λίγα εμπορικά αντιδραστήρια εκχύλισης RNA που μπορούν να είναι κατάλληλα για τους περισσότερους φυτικούς ιστούς.Ευτυχώς, η Foregene μπορεί να προσφέρει ειδικάκιτ εξαγωγής φυτικού RNA, έχουμεΚιτ απομόνωσης ολικού RNA φυτού, Plant Total RNA Isolation Kit Plus.Το τελευταίο είναι ειδικά σχεδιασμένο για φυτά με υψηλή περιεκτικότητα σε πολυσακχαρίτες και πολυφαινόλες.Για την εξαγωγή RNA, η ανατροφοδότηση από τους χρήστες του εργαστηρίου είναι ιδιαίτερα καλή.
12. Η επίδραση της κατάψυξης και της απόψυξης του δείγματος Το κατεψυγμένο δείγμα μπορεί να είναι μεγαλύτερο και πρέπει να κοπεί πριν χρησιμοποιηθεί για εξαγωγή RNA.Τα δείγματα τείνουν να λιώνουν (πιθανώς εν μέρει) κατά την κοπή.Τα κατεψυγμένα δείγματα μπορεί να χρειαστεί να ζυγιστούν πριν από την εκχύλιση RNA και η απόψυξη θα συμβεί σίγουρα κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας.Μερικές φορές, η απόψυξη του δείγματος συμβαίνει επίσης κατά τη διαδικασία άλεσης με υγρό άζωτο.ή το κατεψυγμένο δείγμα προστίθεται απευθείας στο προϊόν λύσης χωρίς άλεση υγρού αζώτου και η απόψυξη θα γίνει οπωσδήποτε πριν από την πλήρη ομογενοποίηση.Πειράματα έδειξαν ότι ο κατεψυγμένος ιστός είναι πιο επιρρεπής στην αποικοδόμηση του RNA κατά την απόψυξη από ότι ο φρέσκος ιστός.Ο πιθανός λόγος: Η διαδικασία παγώματος-απόψυξης διαταράσσει τις δομές μέσα στο κύτταρο, καθιστώντας ευκολότερο για τα ενδογενή ένζυμα να έρθουν σε άμεση επαφή με το RNA.
13. Κρίση της ποιότητας του RNA Συνήθως, η ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται για να κριθεί η ακεραιότητα του RNA και το A260/A280 χρησιμοποιείται για να κριθεί η καθαρότητα του RNA.Θεωρητικά, το ανέπαφο RNA έχει αναλογία 28S:18S = 2,7:1, και τα περισσότερα δεδομένα τονίζουν την αναλογία 28S:18S = 2:1.Το γεγονός είναι ότι σχεδόν κανένα από τα RNA που εξάγονται από δείγματα εκτός από κύτταρα δεν είναι σε αναλογία 2:1 (αυτό ελήφθη χρησιμοποιώντας τον Agilent Bioanalyzer).
Τα αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης του RNA επηρεάζονται από πολλούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της δευτερογενούς δομής, των συνθηκών ηλεκτροφόρησης, του φορτίου του δείγματος, του βαθμού κορεσμού από το EB, κ.λπ. Χρησιμοποιήστε φυσική ηλεκτροφόρηση για την ανίχνευση RNA και χρησιμοποιήστε τον δείκτη DNA ως μάρτυρα.Εάν το 28S στα 2kb και το 18S στα 0,9kb είναι καθαρά και το 28S: 18S > 1, η ακεραιότητα μπορεί να ικανοποιήσει τις απαιτήσεις των περισσότερων επόμενων πειραμάτων.
Το A260/A280 είναι ένας δείκτης που έχει προκαλέσει μεγάλη σύγχυση.Πρώτα απ 'όλα, είναι απαραίτητο να διευκρινιστεί η αρχική έννοια αυτού του δείκτη για τα νουκλεϊκά οξέα: καθαρό RNA, το A260/280 του = περίπου 2,0.Το καθαρό RNA είναι η «αιτία» και το A260/A280 = 2 είναι το «αποτέλεσμα».Τώρα όλοι χρησιμοποιούν το A260/A280 ως «αιτία», πιστεύοντας ότι «αν A260/A280 = 2, τότε το RNA είναι καθαρό», κάτι που φυσικά οδηγεί σε σύγχυση.
Εάν σας ενδιαφέρει, μπορείτε να προσθέσετε λίγο αντιδραστήριο που χρησιμοποιείται συχνά στην εκχύλιση, όπως φαινόλη, ισοθειοκυανική γουανιδίνη, PEG κ.λπ., στο δείγμα RNA σας και στη συνέχεια να μετρήσετε την αναλογία A260/A280.Η πραγματικότητα είναι ότι πολλά από τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την εκχύλιση RNA, καθώς και πολλές ακαθαρσίες στο δείγμα, απορροφούν περίπου τα Α260 και Α280, επηρεάζοντας τα Α260/Α280.
Η πιο διδακτική προσέγγιση επί του παρόντος είναι η σάρωση δειγμάτων RNA στην περιοχή 200-300 nm.Η καμπύλη του καθαρού RNA έχει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: η καμπύλη είναι ομαλή, τα A230 και A260 είναι δύο σημεία καμπής, το A300 είναι κοντά στο 0, το A260/A280 = περίπου 2,0 και το A260/A230 = περίπου 2,0.Εάν δεν υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα σάρωσης, πρέπει επίσης να προσδιοριστεί η αναλογία A260/A230, καθώς αυτή η αναλογία είναι πιο ευαίσθητη στη μεταφορά όλων των ακαθαρσιών που επηρεάζουν την ενζυματική αντίδραση.Λάβετε υπόψη το γραμμικό εύρος της συσκευής (0,1–0,5 για το A260).
Υπάρχουν δύο άλλα χρήσιμα φαινόμενα: η αναλογία θα είναι περίπου 0,3 χαμηλότερη όταν το A260/A280 μετράται σε νερό.ενώ η αναλογία που μετράται σε 10 mM EDTA είναι περίπου 0,2 υψηλότερη από αυτή που μετράται σε 1 mM EDTA.
Σχετικά προϊόντα:
China Plant Total RNA Isolation Kit Κατασκευαστής και Προμηθευτής |Foregene (foreivd.com)
Σειρά απομόνωσης RNA – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Ώρα δημοσίευσης: Ιουλ-15-2022
