Είμαστε έμπειροι κατασκευαστές.Κερδίζοντας την πλειοψηφία στις κρίσιμες πιστοποιήσεις της αγοράς της για Big discounting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Η ποιότητα είναι η εργοστασιακή ζωή, Η εστίαση στη ζήτηση των πελατών είναι η πηγή της επιβίωσης και της ανάπτυξης της εταιρείας, Τηρούμε την ειλικρίνεια και την καλή πίστη στη στάση εργασίας, ανυπομονούμε για τον ερχομό σας!
Είμαστε έμπειροι κατασκευαστές.Κερδίζοντας την πλειοψηφία στις κρίσιμες πιστοποιήσεις της αγοράς της γιαChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Η εταιρεία μας υπόσχεται: λογικές τιμές, σύντομο χρόνο παραγωγής και ικανοποιητική εξυπηρέτηση μετά την πώληση, σας καλωσορίζουμε επίσης να επισκεφτείτε το εργοστάσιό μας οποιαδήποτε στιγμή θέλετε.Μακάρι τώρα να έχουμε μια ευχάριστη και μακροχρόνια επιχείρηση μαζί!!!

Περιγραφές

Αυτό το κιτ χρησιμοποιεί ένα μοναδικό σύστημα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης που μπορεί να απελευθερώσει γρήγορα RNA από δείγματα καλλιεργημένων κυττάρων για αντιδράσεις RT-qPCR, εξαλείφοντας έτσι τη χρονοβόρα και επίπονη διαδικασία καθαρισμού RNA.Το πρότυπο RNA μπορεί να ληφθεί σε μόλις 7 λεπτά.Τα αντιδραστήρια 5×Direct RT Mix και 2×Direct qPCR Mix-SYBR που παρέχονται από το κιτ μπορούν να λάβουν γρήγορα και αποτελεσματικά ποσοτικά αποτελέσματα PCR σε πραγματικό χρόνο.

Το 5×Direct RT Mix και το 2×Direct qPCR Mix-SYBR έχουν ισχυρή ανοχή σε αναστολείς και το προϊόν λύσης των δειγμάτων μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο για RT-qPCR απευθείας.Αυτό το κιτ περιέχει τη μοναδική αντίστροφη μεταγραφάση Foregene υψηλής συγγένειας RNA και την Hot D-Taq DNA πολυμεράση, dNTPs, MgCl₂, ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης, βελτιστοποιητής PCR και σταθεροποιητής.

Προδιαγραφές

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Εξαρτήματα κιτ

Χαρακτηριστικά & πλεονεκτήματα

■ Απλό και αποτελεσματικό: με την τεχνολογία Cell Direct RT, τα δείγματα RNA μπορούν να ληφθούν σε μόλις 7 λεπτά.

■ Η ζήτηση δείγματος είναι μικρή, καθώς μπορούν να ελεγχθούν έως και 10 κύτταρα.

■ Υψηλή απόδοση: μπορεί να ανιχνεύσει γρήγορα RNA σε κύτταρα που έχουν καλλιεργηθεί σε πλάκες 384, 96, 24, 12, 6 φρεατίων.

■ Η γόμα DNA μπορεί να αφαιρέσει γρήγορα τα απελευθερωμένα γονιδιώματα, μειώνοντας σημαντικά τον αντίκτυπο στα επόμενα πειραματικά αποτελέσματα.

■ Το βελτιστοποιημένο σύστημα RT και qPCR καθιστά την αντίστροφη μεταγραφή δύο σταδίων RT-PCR πιο αποτελεσματική και την PCR πιο συγκεκριμένη και πιο ανθεκτική στους αναστολείς αντίδρασης RT-qPCR.

Εφαρμογή κιτ

Πεδίο εφαρμογής: καλλιεργημένα κύτταρα.

- RNA που απελευθερώνεται με λύση δείγματος: ισχύει μόνο για το πρότυπο RT-qPCR αυτού του κιτ.

- Το κιτ μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τους ακόλουθους σκοπούς: ανάλυση γονιδιακής έκφρασης, επαλήθευση του αποτελέσματος σίγησης γονιδίου που προκαλείται από το siRNA, έλεγχος φαρμάκων κ.λπ.

Διάγραμμα

Αποθήκευση και διάρκεια ζωής

Το μέρος I αυτού του κιτ θα πρέπει να φυλάσσεται στους 4℃.Το Μέρος II πρέπει να αποθηκεύεται στους -20℃.

Το Foregene Protease Plus II πρέπει να φυλάσσεται στους 4℃, μην καταψύχεται στους -20℃.

Το αντιδραστήριο 2×Direct qPCR Mix-SYBR πρέπει να φυλάσσεται στους -20℃ στο σκοτάδι.Εάν χρησιμοποιείται συχνά, μπορεί επίσης να αποθηκευτεί στους 4℃ για βραχυπρόθεσμη αποθήκευση (χρήση εντός 10 ημερών). Έχουμε εμπειρία κατασκευαστή.Κερδίζοντας την πλειοψηφία στις κρίσιμες πιστοποιήσεις της αγοράς της για μεγάλες εκπτώσεις Κίνα High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Η ποιότητα είναι η εργοστασιακή ζωή, Η εστίαση στη ζήτηση των πελατών είναι η πηγή της επιβίωσης και της ανάπτυξης της εταιρείας, Τηρούμε την ειλικρίνεια και την καλή πίστη εργασίας, ανυπομονούμε για τον ερχομό σας!
Μεγάλη έκπτωσηChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Η εταιρεία μας υπόσχεται: λογικές τιμές, σύντομο χρόνο παραγωγής και ικανοποιητική εξυπηρέτηση μετά την πώληση, σας καλωσορίζουμε επίσης να επισκεφτείτε το εργοστάσιό μας οποιαδήποτε στιγμή θέλετε.Μακάρι τώρα να έχουμε μια ευχάριστη και μακροχρόνια επιχείρηση μαζί!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Αριθμ.Κατ.DRT-01021/01022

Για κυτταρική άμεση RT-qPCR χρησιμοποιώντας ≤ 1000.000 κύτταρα

Εισαγωγή προϊόντος

Αυτό το προϊόν χρησιμοποιεί ένα μοναδικό σύστημα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης για γρήγορη απελευθέρωση RNA από δείγματα καλλιεργημένων κυττάρων για αντιδράσεις RT-qPCR, εξαλείφοντας τη χρονοβόρα και επίπονη διαδικασία καθαρισμού RNA και μόνο 7 λεπτά για να ληφθεί το απαιτούμενο πρότυπο RNA, με τα αποτελέσματα 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman που παρέχονται γρήγορα και αποτελεσματικά από το kit.

Το 5× Direct RT Mix και το 2× Direct qPCR Mix-Taqman έχουν ισχυρή ανοχή σε αναστολέα και μπορεί να εκτελέσει αποτελεσματική αναστροφή και ειδική ενίσχυση χρησιμοποιώντας το προϊόν λύσης του δείγματος που θα μετρηθεί ως πρότυπο.Το αντιδραστήριο περιέχει Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer and Stabilizer, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί με το ρυθμιστικό λύσης για γρήγορη και εύκολη ανίχνευση δειγμάτων και έχει τα χαρακτηριστικά υψηλής ευαισθησίας, ειδικότητας και σταθερότητας.

Χαρακτηριστικά Προϊόντος

Απλή, αποτελεσματική τεχνολογία Cell Direct RT που χρειάζεται μόλις 7 λεπτά για τη λήψη δειγμάτων RNA.

Οι απαιτήσεις για δείγματα είναι μικρές και μπορούν να χρησιμοποιηθούν τουλάχιστον 10 καλλιεργημένα κύτταρα για πειραματισμό.

Υψηλή απόδοση για ταχεία απόκτηση RNA καλλιεργημένων κυττάρων όπως πλάκες 384, 96, 24, 12 και 6 φρεατίων.

Το DNA Eraser είναι σε θέση να αφαιρεί γρήγορα τα απελευθερωμένα γονιδιώματα, μειώνοντας σημαντικά τον αντίκτυπο στα επόμενα πειραματικά αποτελέσματα.

Τα βελτιστοποιημένα συστήματα RT και qPCR επιτρέπουν την RT-PCR δύο σταδίων με πιο αποτελεσματική αντίστροφη μεταγραφή, ειδικότητα και ισχυρότερη ανοχή αναστολέα αντίδρασης RT-qPCR.

Εφαρμογή κιτ

Πεδίο εφαρμογής: Καλλιεργημένα κύτταρα.

Ερμηνευμένο RNA λύσης δείγματος: χρησιμοποιείται μόνο ως πρότυπο RT-qPCR δύο σταδίων.

Τα κιτ μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τους ακόλουθους σκοπούς: ανάλυση γονιδιακής ρυθμιστικής έκφρασης, δοκιμή αλληλόμορφων, έλεγχος φαρμάκων κ.λπ.

Περιορισμοί κιτ

Ενισχυμένα θραύσματα ≤ 300 bp.

Τα κιτ χρησιμοποιούνται για φρέσκια καλλιέργεια κυττάρων.

Έλεγχος ποιότητας προϊόντων

Σύμφωνα με το Σύστημα Διαχείρισης Ολικής Ποιότητας του FOREGENE, κάθε παρτίδα κιτ της σειράς Cell Direct RT-qPCR ελέγχεται αυστηρά πολλές φορές για να διασφαλιστεί η αξιοπιστία και η σταθερότητα της ποιότητας κάθε παρτίδας κιτ.

Περιεχόμενα κιτ

*:Το Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman μπορεί να αγοραστεί χωριστά, οι λεπτομέρειες παρέχονται στο Παράρτημα 1 (ΣΕΛΙΔΑ 13).

Συνθήκες αποθήκευσης

1. Όροι αποστολής

Όλη η διαδικασία μεταφοράς παγοκυττάρων χαμηλής θερμοκρασίας, για να διασφαλιστεί ότι το κιτ βρίσκεται στην κατάσταση <4 °C.

2. Συνθήκες αποθήκευσης

Αποθηκεύστε το μέρος I στους 4°C και το μέρος II στους -20°C.

Το Foregene Protease Plus II πρέπει να φυλάσσεται στους 4°C, όχι να καταψύχεται στους -20°C.

Το Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman φυλάσσεται στους -20°C ή στους 4°C για βραχυπρόθεσμη χρήση εάν χρησιμοποιείται συχνά (εντός 10 ημερών).

Πληροφορίες εξαρτημάτων κιτ

Ρυθμιστικό διάλυμα CL: Παρέχει το περιβάλλον που απαιτείται για τις αντιδράσεις λύσης των κυττάρων.

Ρυθμιστικό διάλυμα ST: Τερματίζει τη δραστική ουσία στο λύμα για την αποφυγή επιδράσεων στην επακόλουθη RT.

DNA Eraser: Αφαίρεση DNA, το αποτέλεσμα της αφαίρεσης του γονιδιώματος σε επόμενα πειράματα.

5× Direct RT Mix: Περιέχει υψηλής συγγένειας RNA Foregene Reverse Transcriptase, αναστολέα RNase, dNTPs, σταθεροποιητές, ενισχυτές, βελτιστοποιητές και εκκινητές αντίστροφης μεταγραφής για βέλτιστη ευθυγράμμιση (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Αλφαβητάρι).

Foregene Protease Plus II: Στο πλαίσιο του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, τα κύτταρα λύονται για να απελευθερώσουν νουκλεϊκά οξέα.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Αυτό το αντιδραστήριο περιέχει Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης, βελτιστοποιητής PCR και σταθεροποιητής.

Βαφή αναφοράς 20× ROX: Χρησιμοποιείται γενικά σε όργανα ενίσχυσης PCR σε πραγματικό χρόνο της ABI, της Stratagene και άλλων εταιρειών, χρησιμοποιείται για τη ρύθμιση της διαφοράς μεταξύ σωλήνων PCR και σωλήνων που προκαλούνται από σφάλματα δοσολογίας PCR.Η συγκέντρωση βαφής αναφοράς 20× ROX που απαιτείται για διαφορετικά όργανα είναι διαφορετική και ο χρήστης μπορεί να την προσθέσει σύμφωνα με τη συνιστώμενη συγκέντρωση του οργάνου.

ddH χωρίς RNase₂O: Αποστειρωμένο εξαιρετικά καθαρό νερό χωρίς RNase για αντιδράσεις RT-qPCR δύο σταδίων.

Προφυλάξεις:(Βεβαιωθείτε ότι έχετε διαβάσει προσεκτικά τις προφυλάξεις πριν χρησιμοποιήσετε το κιτ)

Δώστε προσοχή στη μέθοδο λειτουργίας του πειράματος για να αποφύγετε τη διασταυρούμενη μόλυνση μεταξύ των δειγμάτων.

Δώστε προσοχή στην καθαριότητα του πειραματικού περιβάλλοντος και των σκευών για να αποφύγετε τη μόλυνση με RNase και την υποβάθμιση του RNA.

Λαμβάνετε φρέσκα ή καλά διατηρημένα δείγματα κυττάρων και μην χρησιμοποιείτε ποτέ επαναλαμβανόμενα δείγματα κυττάρων που έχουν αποψυχθεί.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman θα πρέπει να αποφεύγει την επαναλαμβανόμενη κατάψυξη-απόψυξη, διαφορετικά θα επηρεάσει την αντίστροφη μεταγραφή και την αποτελεσματικότητα της PCR.

Prepaμερίδεςπρινλειτουργία

Φροντίστε να διαβάσετε προσεκτικά τις οδηγίες πριν χρησιμοποιήσετε αυτό το κιτ.Το κιτ Cell Direct RT-qPCR είναι απλό, βολικό και γρήγορο στη χρήση και οι οδηγίες παρέχουν πλήρεις πληροφορίες για ολόκληρο το κιτ και τον τρόπο σωστής χρήσης του.Παρακαλούμε προετοιμάστε τα απαραίτητα πειραματικά υλικά και εξοπλισμό πριν από τη χρήση.

Πειραματικά υλικά και εξοπλισμός

◆ Κύτταρα καλλιέργειας.

◆ 1,5 ml ή 2 ml, φυγόκεντρος σωλήνας χωρίς RNase/DNase, ρύγχος χωρίς RNase/DNase, στείρος σωλήνας qPCR 0,2 ml.

◆ μηχανή qPCR, πιπέτα, επιτραπέζια φυγόκεντρος (≥13.400×ζ) (ανάλογα με τις πειραματικές ανάγκες) κ.λπ.

Ασφάλεια

◆ Αυτό το προϊόν προορίζεται μόνο για σκοπούς επιστημονικής έρευνας, μην το χρησιμοποιείτε για φαρμακευτικούς, κλινικούς, τροφικούς και καλλυντικούς σκοπούς.

◆ Όταν χρησιμοποιείτε χημικά, φοράτε κατάλληλα εργαστηριακά ρούχα, γάντια, προστατευτικά γυαλιά κ.λπ.

Λειτουργίαοδηγούς

Τα συστήματα Cell Lysis, τα συστήματα RT και οι συσκευασίες συμπληρωμάτων διαλύματος αντίδρασης qPCR μπορούν να αγοραστούν χωριστά, για λεπτομέρειες στο Παράρτημα 1 (ΣΕΛΙΔΑ 13).

Οδηγός λειτουργίας

Α: Δείγμα απελευθέρωσης RNA

1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία: Πλύνετε την πλάκα κυτταροκαλλιέργειας με ψυχρό PBS και στη συνέχεια λύστε τα κύτταρα (10-10⁶), 10⁶ από την ποσότητα των κυττάρων, συνιστάται Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) ή Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) για εκχύλιση και καθαρισμό RNA.

1.1.Προσκολλημένα κύτταρα (πλάκα 24 φρεατίων για παράδειγμα)

1.1.1.Προσδιορίστε τον αριθμό των κυττάρων σε κάθε φρεάτιο, προσδιορίστε ότι ο αριθμός των κυττάρων είναι 1 × 10⁵και χρησιμοποιήστε μια πιπέτα για να αφαιρέσετε το μέσο καλλιέργειας από το δίσκο καλλιέργειας.

1.1.2.Προσθέστε 200 μl προψυγμένου 1 × PBS σε κάθε φρεάτιο.Μην κάνετε επαναλαμβανόμενες πιπέτες και αφαιρέστε το PBS από τα φρεάτια.Γείρετε την πλάκα και αφαιρέστε όσο το δυνατόν περισσότερο PBS.Προχωρήστε στο βήμα 2.

1.1.3.Διαφορετικό δίσκο κυτταροκαλλιέργειας ή πίνακας με αριθμό αναφοράς 1-1 σε δίσκο κυτταροκαλλιέργειας προστέθηκε προψυγμένο 1 χ PBS για έκπλυση κυττάρων.

Πίνακας 1-1: Δοσολογία PBS για διαφορετικούς αριθμούς κυττάρων

Σημείωση:Για να εξασφαλίσετε σταθερά προσκολλημένα κύτταρα,ένας μεγάλος αριθμός απώλειας κυττάρων αποφεύγεται κατά το πλύσιμο.

1.2.Κύτταρα εναιωρήματος ή προσκολλημένα κύτταρα καλλιεργημένα σε μη πορώδεις πλάκες

1.2.1.Προσκολλημένα κύτταρα που καλλιεργούνται σε πλάκες χωρίς πολλαπλά φρεάτια (τα κύτταρα εναιωρήματος ξεκινούν από το επόμενο βήμα 1.2.2), συλλέγουν και διαχωρίζουν τα κύτταρα σύμφωνα με τη συνήθη μέθοδο συλλογής κυττάρων και τα τοποθετούν σε πλάκα καλλιέργειας ή σωλήνα φυγοκέντρησης.εάν χρησιμοποιείται θρυψίνη, απαιτείται φυγοκέντρηση για τη συλλογή των κυττάρων και για την απομάκρυνση της υπολειμματικής θρυψίνης, προστίθενται κύτταρα που έχουν επαναιωρηθεί με PBS σε μεμονωμένα κύτταρα για τη διασπορά των κυττάρων.

1.2.2.Μετά τον αριθμό των κελιών που μετρήθηκαν, μοιράστηκαν τα κελιά 1×10⁵ ένα για να φυγοκεντρήσετε τους σωλήνες, συλλέξτε τα κύτταρα με φυγοκέντρηση στα 1000 × g για 10 λεπτά.

1.2.3.Προσθέστε 200 μl PBS στο σωληνάριο της φυγοκέντρησης, μην επαναλαμβάνετε με πιπέτα και αναρροφήστε απευθείας το PBS.προχωρήστε στο βήμα 2. (Εάν είναι δύσκολο να κατακρημνιστεί και τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν, μπορεί να γίνει φυγοκέντρηση 1000×g 10 λεπτά μετά την απόρριψη του υπερκειμένου, το σφαιρίδιο κυττάρων προχωρήστε στο βήμα 2)

2.Λύση κυττάρων: Αφαιρέστε το ρυθμιστικό διάλυμα CL, τη θερμοκρασία του εξισορροπημένη σε θερμοκρασία δωματίου, το DNA Eraser και το Foregene Protease Plus II, σύμφωνα με τον ακόλουθο πίνακα 1-2 παρασκευασμένο σύστημα λύσης: (Το διάλυμα λύσης είναι έτοιμο για χρήση).

Πίνακας 1-2: διάσπαση προετοιμασία συστήματος (Σημείωση: στην προετοιμασία σε πάγο)

3. ( Πλάκα 24 φρεατίων για παράδειγμα ) Ρίξτε με σιφώνιο 200 μl κύριου μίγματος λύσης κυττάρων σε κάθε φρεάτιο, φυσήξτε επανειλημμένα 5-10 φορές, Επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 ℃) για 5 λεπτά.

Σημείωση:Για να αποφύγετε το σχηματισμό φυσαλίδων, παρακαλούμε όταν η κλίμακα της πιπέτας ρυθμίστηκε στα 200μl ή λιγότερο.Τα κύτταρα μπορεί να φαίνονται θολά μετά τη λύση, κάτι που είναι φυσιολογικό.

4. (πλάκα 24 φρεατίων για παράδειγμα) προστίθεται στο υγρό 20 μl ρυθμιστικού διαλύματος ST (διαφορετικά συστήματα λύσης Το ρυθμιστικό διάλυμα ST προστέθηκε σε ποσότητα που φαίνεται στον Πίνακα 1-3), επαναλήφθηκε με πιπέτα 5-10 φορές, σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 ℃) επωάστηκαν για 2 λεπτά.

Σημείωση:Το άκρο της πιπέτας τοποθετήθηκε κάτω από την επιφάνεια, διασφαλίζοντας ότι προστέθηκε το προϊόν λύσης,Για να αποφύγετε το σχηματισμό φυσαλίδων, παρακαλούμε όταν η κλίμακα της πιπέτας ρυθμίστηκε στα 200μl ή λιγότερο.

Πίνακας 1-3:Προσθήκη buffer ST

5. Το προϊόν λύσης χρησιμοποιείται για μετέπειτα πειράματα RT-qPCR.Εάν τα επόμενα πειράματα δεν μπορούν να εκτελεστούν εγκαίρως, κρατήστε το στον πάγο για όχι περισσότερο από 2 ώρες και αποθηκεύστε το στους -20℃ ή -80 ℃ (όχι περισσότερο από τρεις μήνες).

Β: Προετοιμασία συστήματος RT

1. Βγάλτε το 5 × Direct RT Mix και τοποθετήστε το σε παγόλουτρο, αφήστε το να λιώσει φυσικά και ανακατέψτε το απαλά για μελλοντική χρήση.Βγάλτε το ddH2O Χωρίς RNase και λιώστε το και τοποθετήστε το σε παγόλουτρο για μελλοντική χρήση.Προετοιμάστε το σύστημα αντίδρασης σε πάγο σύμφωνα με τον Πίνακα 2-1 παρακάτω.

Πίνακας 2-1: Παρασκευή συστήματος αντίδρασης RT

2. Μετά την ολοκλήρωση της σύνθεσης του συστήματος, αναμειγνύεται ήπια και φυγοκεντρείται σύντομα στον παρακάτω πίνακα 2 -2 Συνθήκες αντίδρασης Αντίδραση RT.

Πίνακας 2-2: Ρύθμιση συνθήκης αντίδρασης RT

3. Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης, το προϊόν της αντίδρασης τοποθετήθηκε απευθείας στον πάγο για qPCR, παρακαλούμε βάλτε τη μακροχρόνια συντήρηση -20℃ ή -80 ℃.

Σημείωση: Λόγω της χρήσης μη καθαρισμένου προτύπου, ενδέχεται να εμφανιστούν λευκά ιζήματα στο προϊόν αντίστροφης μεταγραφής.Αυτό είναι ένα φυσιολογικό φαινόμενο.Φυγοκεντρήστε το υπερκείμενο αμέσως για τα επόμενα πειράματα.

Το προκύπτον διάλυμα αντίδρασης RT προστίθεται στα συστήματα αντίδρασης PCR επόμενου Βήματος σε πραγματικό χρόνο, συνιστάται η προσθήκη ποσοτήτων που κυμαίνονται από 10-30% του συστήματος αντίδρασης.

C: Παρασκευή συστήματος αντίδρασης qPCR

1. Κατάλληλη ποσότητα Β που παρασκευάστηκε στο εκμαγείο cDNA σταδίου σύμφωνα με τον ακόλουθο πίνακα 3-1 για την παρασκευή ενός συστήματος αντίδρασης.

Σημείωση: Η ποσότητα του προτύπου cDNA αντιστοιχεί στο 10-30% του συστήματος qPCR.Για παράδειγμα, σε ένα σύστημα qPCR 20 μl, προσθέστε 2-6 μl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, αλλά όχι περισσότερο από 6 μl.

2. Οι καλές συνθήκες βελτιστοποίησης qPCR (Θερμοκρασία ανόπτησης κ.λπ.) για την αντίδραση qPCR (Οι συνθήκες αντίδρασης που δίνονται στον Πίνακα 3-2).

Σημείωση: Προσπαθήστε να χρησιμοποιήσετε βελτιστοποιημένες συνθήκες για αντιδράσεις qPCR για να έχετε καλύτερα αποτελέσματα.

Πίνακας 3-1: Παρασκευή συστήματος αντίδρασης PCR

1*: Η συγκέντρωση του εκκινητή μπορεί να ρυθμιστεί στο εύρος των 50-900 nM όταν η απόδοση της αντίδρασης εκκινητή είναι κακή.

Σημείωση: Το σύστημα qPCR μπορεί να ρυθμιστεί σύμφωνα με τις πειραματικές ανάγκες και το μοντέλο κυκλοποιητή φθορισμού.Για qPCR σε 50μl, προσαρμόστε τη δόση του αντιδραστηρίου αναλογικά σύμφωνα με το 20μl σύστημα.

2*: Επιλέξτε την κατάλληλη τελική συγκέντρωση της βαφής αναφοράς ROX σύμφωνα με τον ποσοτικό θερμικό κυκλωτή φθορισμού.Οι καταλληλότερες συγκεντρώσεις Βαφής Αναφοράς ROX για κοινούς ποσοτικούς κυκλοποιητές φθορισμού φαίνονται στον παρακάτω πίνακα:

Πίνακας 3-2: Παρέχονται συνθήκες αντίδρασης qPCR

Σημείωση: Προκειμένου να επιτευχθεί το καλύτερο αποτέλεσμα qPCR, μπορεί να χρησιμοποιηθεί βαθμιδωτή PCR για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών αντίδρασης για διαφορετικά πρότυπα και διαφορετικούς εκκινητές.Οι συνθήκες αντίδρασης PCR ποικίλλουν ανάλογα με τον αναλυτή φθορισμού, το εκμαγείο, τον εκκινητή κ.λπ. Στη συγκεκριμένη λειτουργία, οι βέλτιστες συνθήκες αντίδρασης πρέπει να σχεδιάζονται σύμφωνα με τις ειδικές συνθήκες του ποσοτικού θερμικού κυκλωτή φθορισμού, τον τύπο του προτύπου, το μέγεθος του θραύσματος ενδιαφέροντος, την αλληλουχία βάσης του ενισχυμένου θραύσματος και το περιεχόμενο GC και τη διάρκεια θερμοκρασίας αντίδρασης, συμπεριλαμβανομένου χρόνου αντίδρασης κ.λπ.

Αρχές σχεδίασης εκκινητών PCR σε πραγματικό χρόνο

Forward Primer και Reverse Primer

Για Real Time PCR, ο σχεδιασμός του εκκινητή είναι πολύ σημαντικός.Οι εκκινητές σχετίζονται με την ειδικότητα και την αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης PCR και μπορούν να σχεδιαστούν με αναφορά στις ακόλουθες αρχές:

◆ Μήκος ασταριού: 18-30bp.

◆ Περιεκτικότητα σε GC: 40-60%.

◆ Τιμή Tm: Το λογισμικό σχεδιασμού Primer, όπως το Primer 5, μπορεί να δώσει την τιμή Tm του αστάρι.Οι τιμές Tm των εκκινητών ανάντη και κατάντη θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πιο κοντά.Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ο τύπος υπολογισμού Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Κατά την εκτέλεση PCR, ως θερμοκρασία ανόπτησης επιλέγεται γενικά μια θερμοκρασία κάτω από την τιμή Tm εκκινητή των 5 °C (η αντίστοιχη αύξηση στη θερμοκρασία ανόπτησης μπορεί να αυξήσει την ειδικότητα της αντίδρασης PCR).

◆ Primers και προϊόντα PCR:

◆ Το μήκος του προϊόντος ενίσχυσης PCR εκκινητή σχεδιασμού είναι κατά προτίμηση 100-150 bp.

◆ Τα αστάρια σχεδιασμού στη δευτερεύουσα δομική περιοχή του προτύπου θα πρέπει να αποφεύγονται όσο το δυνατόν περισσότερο.

◆ Αποφύγετε το σχηματισμό 2 ή περισσότερων συμπληρωματικών βάσεων μεταξύ των άκρων 3' των ανάντη και κατάντη εκκινητών.

◆ Η τερματική βάση αστάρι 3′ δεν μπορεί να υπάρχει με 3 επιπλέον διαδοχικά G ή C.

◆ Οι ίδιοι οι εκκινητές δεν μπορούν να έχουν συμπληρωματικές δομές, διαφορετικά θα σχηματιστεί μια δομή φουρκέτας, η οποία επηρεάζει την ενίσχυση PCR.

◆ Το ATCG θα πρέπει να κατανέμεται όσο το δυνατόν πιο ομοιόμορφα στην ακολουθία εκκινητών και η 3' τερματική βάση θα πρέπει να αποφεύγεται ως T.

παράρτημα1:Cell DirectRT-qPCR Εξάρτημα κιτt πακέτο συμπληρωμάτων

1.Διάλυμα κυτταρικής λύσης