1. Αρχική κατανόηση

Σε αυτό το στάδιο, πρέπει να κατανοήσουμε ορισμένες έννοιες και ορολογία, ώστε να αποφύγουμε να κάνουμε λάθη μπροστά στους ηλικιωμένους μας, όπως:

Ε: Ποια είναι η διαφορά μεταξύ RT-PCR, qPCR, PCR πραγματικού χρόνου και RT-PCR πραγματικού χρόνου;

Απάντηση: Η RT-PCR είναι PCR αντίστροφης μεταγραφής(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), η οποία είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη παραλλαγή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR).Στην RT-PCR, ένας κλώνος RNA μεταγράφεται αντίστροφα σε συμπληρωματικό DNA, το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιείται ως πρότυπο για ενίσχυση DNA με PCR.
Real-time-PCR και qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) είναι το ίδιο πράγμα, και τα δύο είναι ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο, πράγμα που σημαίνει ότι κάθε κύκλος PCR έχει εγγραφές δεδομένων σε πραγματικό χρόνο, επομένως ο αριθμός των αρχικών προτύπων μπορεί να ρυθμιστεί με ακριβή ανάλυση.

Παρόλο που τόσο η PCR πραγματικού χρόνου (fluorescent quantitative PCR σε πραγματικό χρόνο) όσο και η PCR αντίστροφης μεταγραφής (reverse transcription PCR) φαίνεται να συντομεύονται ως RT-PCR, η διεθνής σύμβαση είναι: Η RT-PCR αναφέρεται συγκεκριμένα στην αντίστροφη μεταγραφήPCR , Η PCR πραγματικού χρόνου γενικά συντομεύεται ως qPCR (ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο).

Και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR (RT-qPCR), Είναι η PCR αντίστροφης μεταγραφής σε συνδυασμό με την ποσοτική τεχνολογία φθορισμού: πρώτα λάβετε cDNA (RT) από αντίστροφη μεταγραφή RNA και στη συνέχεια χρησιμοποιήστε PCR πραγματικού χρόνου για ποσοτική ανάλυση (qPCR).Τα περισσότερα εργαστήρια κάνουν RT-qPCR, δηλαδή έρευνα για την προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης RNA, οπότε η qPCR για την οποία μιλούν όλοι στο εργαστήριο αναφέρεται στην πραγματικότητα σε RT-qPCR, αλλά μην ξεχνάτε ότι υπάρχουν ακόμα πολλές εξετάσεις DNA σε κλινικές εφαρμογές.Ποσοτική ανάλυση, όπως ανίχνευση HBV ιού ηπατίτιδας Β.

Ερώτηση: Αφού διαβάσετε πολλή φθορίζουσα ποσοτική PCR, γιατί πρέπει το ενισχυμένο θραύσμα να ελέγχεται εντός του εύρους των 80-300 bp;

Απάντηση: Το μήκος κάθε αλληλουχίας γονιδίου είναι διαφορετικό, μερικά είναι πολλά kb, μερικά είναι εκατοντάδες bp, αλλά χρειάζεται μόνο να απαιτήσουμε το μήκος του προϊόντος να είναι 80-300 bp όταν σχεδιάζουμε εκκινητές, πολύ βραχείς ή πολύ μεγάλοι δεν είναι κατάλληλοι για φθορίζουσα ποσοτική ανίχνευση PCR.Το θραύσμα προϊόντος είναι πολύ κοντό για να διακριθεί από το εκκινητή-διμερές.Το μήκος του ασταριού-διμερούς είναι περίπου 30-40 bp, και είναι δύσκολο να διακρίνει κανείς αν είναι αστάρι-διμερές ή προϊόν εάν είναι μικρότερο από 80 bp.Εάν το θραύσμα προϊόντος είναι πολύ μακρύ, υπερβαίνει τα 300 bp, θα οδηγήσει εύκολα σε χαμηλή απόδοση ενίσχυσης και δεν μπορεί να ανιχνεύσει αποτελεσματικά την ποσότητα του γονιδίου.

Για παράδειγμα, όταν μετράτε πόσα άτομα βρίσκονται σε μια τάξη, χρειάζεται μόνο να μετρήσετε πόσα στόματα υπάρχουν.Το ίδιο ισχύει όταν ανιχνεύετε γονίδια, χρειάζεται μόνο να ανιχνεύσετε μια συγκεκριμένη αλληλουχία ενός γονιδίου για να αναπαραστήσετε Ολόκληρη η αλληλουχία θα κάνει.Αν θέλετε να μετράτε ανθρώπους, πρέπει να μετράτε και το στόμα και τη μύτη, τα αυτιά και τα γυαλιά, και είναι εύκολο να κάνετε λάθη.

Για να επεκταθεί, στη βιολογική έρευνα, υπάρχουν πολλές ερευνητικές περιπτώσεις από σημείο σε περιοχή, επειδή η γονιδιακή αλληλουχία οποιουδήποτε είδους είναι πολύ μεγάλη, είναι περιττό και αδύνατο να μετρηθούν όλα τα θραύσματα, όπως η βακτηριακή αλληλουχία 16S, η οποία είναι η διεξαγωγή της συντηρητικής αλληλουχίας βακτηριακών δοκιμών για να συμπεράνουμε τον αριθμό ενός συγκεκριμένου πληθυσμού βακτηρίων.

Ε: Ποιο είναι το βέλτιστο μήκος για το σχεδιασμό του εκκινητή qPCR;

Απάντηση: Γενικά, το μήκος του ασταριού είναι περίπου 20-24 bp, που είναι καλύτερο.Φυσικά, πρέπει να προσέχουμε την τιμή TM του ασταριού όταν σχεδιάζουμε το αστάρι, γιατί αυτό σχετίζεται με τη βέλτιστη θερμοκρασία ανόπτησης.Μετά από πολλά πειράματα, έχει αποδειχθεί ότι οι 60°C είναι καλύτερη τιμή TM.Εάν η θερμοκρασία ανόπτησης είναι πολύ χαμηλή, θα οδηγήσει εύκολα σε μη ειδική ενίσχυση.Εάν η θερμοκρασία ανόπτησης είναι πολύ υψηλή, η απόδοση ενίσχυσης θα είναι σχετικά χαμηλή, η κορυφή της καμπύλης ενίσχυσης θα ξεκινήσει αργότερα και η τιμή CT θα καθυστερήσει.

Ε: Πώς διαφέρει η μέθοδος βαφής από τη μέθοδο ανιχνευτή;

Απάντηση: Μέθοδος βαφήςΟρισμένες φθορίζουσες βαφές, όπως το SYBR Green Ⅰ, το PicoGreen, το BEBO, κ.λπ., δεν εκπέμπουν φως από μόνες τους, αλλά θα εκπέμπουν φθορισμό μετά τη δέσμευση στο μικρό αυλάκι του δίκλωνου DNA.Επομένως, στην αρχή της αντίδρασης PCR, το μηχάνημα δεν μπορεί να ανιχνεύσει το φθορίζον σήμα.Όταν η αντίδραση φτάσει στο στάδιο ανόπτησης-επέκτασης, ο διπλός κλώνος ανοίγεται και ένας νέος κλώνος συντίθεται υπό τη δράση της DNA πολυμεράσης και το φθορίζον μόριο συνδέεται με τη δευτερεύουσα αύλακα dsDNA.Καθώς ο αριθμός των κύκλων PCR αυξάνεται, όλο και περισσότερες βαφές συνδυάζονται με δίκλωνο DNA και το σήμα φθορισμού επίσης ενισχύεται συνεχώς.Η μέθοδος της βαφής χρησιμοποιείται κυρίως στην επιστημονική έρευνα.
ΥΓ: Προσέξτε όταν κάνετε το πείραμα, η βαφή πρέπει να συνδυαστεί με ανθρώπινο DNA, να προσέχετε να τη μετατρέψετε σε φθορίζον άτομο.

Μέθοδος βαφής (αριστερά) Μέθοδος ανιχνευτή (δεξιά)
ΥΓ: Προσέξτε όταν κάνετε το πείραμα, η βαφή πρέπει να συνδυαστεί με ανθρώπινο DNA, να προσέχετε να τη μετατρέψετε σε φθορίζον άτομο.

Το SYBR Green Ⅰ συνδέεται με τη δευτερεύουσα αύλακα του DNA

Μέθοδος ανιχνευτήΟ ανιχνευτής Taqman είναι ο πιο συχνά χρησιμοποιούμενος ανιχνευτής υδρόλυσης.Υπάρχει μια φθορίζουσα ομάδα στο 5' άκρο του ανιχνευτή, συνήθως FAM, και ο ίδιος ο ανιχνευτής είναι μια αλληλουχία συμπληρωματική του γονιδίου στόχου.Υπάρχει μια φθορίζουσα ομάδα σβέσης στο άκρο 3′.Σύμφωνα με την αρχή της μεταφοράς ενέργειας συντονισμού φθορισμού (μεταφορά ενέργειας συντονισμού Förster, FRET), όταν η ομάδα φθορισμού ανταποκριτή (φθορίζον μόριο δότη) και η ομάδα φθορισμού σβέσης (φθορίζον μόριο δέκτη) διεγείρονται Όταν τα φάσματα επικαλύπτονται και η ελάττωση της απόστασης (7-10). ο φθορισμός του μορίου δέκτη, ενώ ο αυτοφθορισμός εξασθενεί.Επομένως, στην αρχή της αντίδρασης PCR, όταν ο ανιχνευτής είναι ελεύθερος και άθικτος στο σύστημα, η ομάδα φθορισμού αναφοράς δεν θα εκπέμψει φθορισμό.Κατά την ανόπτηση, το αστάρι και ο ανιχνευτής συνδέονται με το πρότυπο.Κατά τη διάρκεια του σταδίου επέκτασης, η πολυμεράση συνθέτει συνεχώς νέες αλυσίδες.Η DNA πολυμεράση έχει δραστικότητα εξωνουκλεάσης 5'-3'.Όταν φτάσει στον ανιχνευτή, η DNA πολυμεράση θα υδρολύσει τον ανιχνευτή από το εκμαγείο, θα διαχωρίσει τη φθορίζουσα ομάδα αναφοράς από τη φθορίζουσα ομάδα απόσβεσης και θα απελευθερώσει το φθορίζον σήμα.Δεδομένου ότι υπάρχει μια σχέση ένα προς ένα μεταξύ του ανιχνευτή και του εκμαγείου, η μέθοδος ανιχνευτή είναι ανώτερη από τη μέθοδο βαφής όσον αφορά την ακρίβεια και την ευαισθησία της δοκιμής.Η μέθοδος ανιχνευτή χρησιμοποιείται κυρίως στη διάγνωση.

Ε: Τι είναι η απόλυτη ποσοτικοποίηση;Τι είναι η σχετική ποσοτικοποίηση;

Απάντηση: Η απόλυτη ποσοτικοποίηση αναφέρεται στον υπολογισμό του αρχικού αριθμού αντιγράφων του δείγματος που θα ελεγχθεί με qPCR, όπως πόσοι ιοί HBV υπάρχουν σε 1 ml αίματος.Το αποτέλεσμα που λαμβάνεται με σχετική ποσοτικοποίηση είναι η αλλαγή στην ποσότητα του γονιδίου στόχου σε ένα συγκεκριμένο δείγμα σε σχέση με ένα άλλο δείγμα αναφοράς και η έκφραση του γονιδίου ρυθμίζεται προς τα πάνω ή προς τα κάτω.

Ε: Η ποσότητα της εξαγωγής RNA, η αποτελεσματικότητα της αντίστροφης μεταγραφής και η αποτελεσματικότητα ενίσχυσης θα επηρεάσουν τα πειραματικά αποτελέσματα;
Ε: Η αποθήκευση δειγμάτων, τα αντιδραστήρια εκχύλισης, τα αντιδραστήρια αντίστροφης μεταγραφής και τα αναλώσιμα που μεταδίδουν φως θα επηρεάσουν τα πειραματικά αποτελέσματα;
Ε: Ποια μέθοδος μπορεί να διορθώσει τα πειραματικά δεδομένα;

Σχετικά με αυτά τα ζητήματα, θα τα περιγράψουμε λεπτομερώς στις παρακάτω ενότητες για προχωρημένους και προχωρημένους.
2. Προχωρημένες γνώσεις

Όσον αφορά την ποσοτική PCR φθορισμού σε πραγματικό χρόνο, πρέπει να αναγνωρίσουμε την πραγματικότητα ότι χιλιάδες επιστημονικές ερευνητικές εργασίες δημοσιεύονται κάθε χρόνο, μεταξύ των οποίων η τεχνολογία φθορισμού ποσοτικής PCR δεν είναι μικρός αριθμός.

Εάν δεν υπάρχει κοινό πρότυπο για τη μέτρηση του πειράματος φθορίζουσας ποσοτικής PCR, τα αποτελέσματα ενδέχεται να διαφέρουν πολύ.Για το ίδιο γονίδιο του ίδιου είδους, με την ίδια μέθοδο επεξεργασίας, τα αποτελέσματα ανίχνευσης θα ποικίλλουν επίσης ευρέως και θα είναι δύσκολο για τους καθυστερημένους να επαναλάβουν τα ίδια αποτελέσματα.Εσείς Κανείς δεν ξέρει ποιο είναι σωστό και ποιο λάθος.

Σημαίνει αυτό ότι η φθορίζουσα ποσοτική PCR είναι μια τεχνολογία εξαπάτησης ή μια αναξιόπιστη τεχνολογία;Όχι, είναι επειδή η φθορίζουσα ποσοτική PCR είναι πιο ευαίσθητη και ακριβέστερη, και μια μικρή λανθασμένη λειτουργία θα παράγει εντελώς αντίθετα αποτελέσματα.Μια μικρή απώλεια είναι χίλια μίλια μακριά.Ο συγγραφέας του άρθρου μπορεί να βασανιστεί επανειλημμένα από τους αναθεωρητές.Ταυτόχρονα, οι κριτές του περιοδικού είναι επίσης δύσκολο να επιλέξουν από διαφορετικά πειραματικά αποτελέσματα.

Συνολικά, υποδεικνύοντας την έλλειψη συναίνεσης στα πειράματα PCR σε πραγματικό χρόνο.Για το σκοπό αυτό, ανώτεροι επιστήμονες του κλάδου άρχισαν να διαμορφώνουν πρότυπα,απαιτώντας από τους συνεισφέροντες να παρέχουν ορισμένες απαραίτητες πειραματικές λεπτομέρειες και λεπτομέρειες επεξεργασίας δεδομένων (συμπεριλαμβανομένων των απαραίτητων δεδομένων) στο άρθρο για την τήρηση αυτών των προτύπων .

Οι αναθεωρητές μπορούν να κρίνουν την ποιότητα του πειράματος διαβάζοντας αυτές τις λεπτομέρειες.Οι μελλοντικοί αναγνώστες μπορούν επίσης να το χρησιμοποιήσουν για να επαναλάβουν το πείραμα ή να βελτιώσουν το πείραμα.Στη συνέχεια, τα πειραματικά αποτελέσματα που λαμβάνονται με αυτόν τον τρόπο είναι γεμάτα πληροφορίες, υψηλής ποιότητας και αξιοποιήσιμα.

MIBBI (Ελάχιστες πληροφορίες για βιολογικές και βιοϊατρικές έρευνες -http://www.mibbi.org) δημιουργήθηκε.Το MIBBI είναι ένα έργο που παρέχει πρότυπα για πειράματα.Δημοσιεύεται στη φύση.Αυτό το έργο στοχεύει σε διάφορα βιολογικά πειράματα, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής βιολογίας, Microarray, qPCR που πρόκειται να συζητήσουμε τώρα, κ.λπ., και προβλέπει κάθε τύπο πειράματος κατά την υποβολή χειρογράφων.Αυτές οι πληροφορίες πρέπει να παρέχονται ανά πάσα στιγμή.

Στο έργο MIBBI, υπάρχουν δύο άρθρα που σχετίζονται με τη φθορίζουσα ποσοτική PCR, συγκεκριμένα:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – ένας οδηγός δομημένης γλώσσας και αναφοράς για ποσοτικά δεδομένα PCR σε πραγματικό χρόνο.
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – ελάχιστες πληροφορίες για τη δημοσίευση άρθρων σχετικά με ποσοτικά πειράματα PCR σε πραγματικό χρόνο.
Αρχικά, ας μιλήσουμε για το RDML, την προδιαγραφή ορολογίας.

Εάν δεν υπάρχει τυπικός ορισμός για τα πάντα, είναι αδύνατο να συνεχιστεί η συζήτηση, γι' αυτό η εξήγηση των όρων είναι τόσο σημαντική στην εξέταση.
Η ορολογία που χρησιμοποιείται στο πείραμα φθορίζουσας ποσοτικής PCR περιλαμβάνει το ακόλουθο περιεχόμενο.Η QIAGEN έκανε την καλύτερη περίληψη για εμάς.Τα παρακάτω είναι όλα στεγνάεμπορεύματα .

Καμπύλη ενίσχυσης
Η καμπύλη ενίσχυσης αναφέρεται στην καμπύλη που δημιουργείται κατά τη διαδικασία PCR, με τον αριθμό κύκλου ως τετμημένη και την ένταση φθορισμού σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια της αντίδρασης ως τεταγμένη.

Μια εξαιρετική καμπύλη ενίσχυσης θα πρέπει να έχει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: η γραμμή βάσης είναι επίπεδη ή ελαφρώς μειωμένη και δεν υπάρχει εμφανής ανοδική τάση.το σημείο καμπής της καμπύλης είναι καθαρό και η κλίση της εκθετικής φάσης είναι ανάλογη με την απόδοση ενίσχυσης.Όσο μεγαλύτερη είναι η κλίση, τόσο μεγαλύτερη είναι η απόδοση ενίσχυσης.η συνολική καμπύλη ενίσχυσης Ο παραλληλισμός είναι καλός, υποδεικνύοντας ότι η απόδοση ενίσχυσης κάθε σωλήνα είναι παρόμοια.η εκθετική φάση της καμπύλης ενίσχυσης των δειγμάτων χαμηλής συγκέντρωσης είναι προφανής.

Γραμμή βάσης (Βασική γραμμή)
Η βασική γραμμή είναι το επίπεδο θορύβου του πρώιμου κύκλου, συνήθως μετράται μεταξύ του 3ου και του 15ου κύκλου, επειδή η αύξηση της τιμής φθορισμού που προκαλείται από το προϊόν ενίσχυσης δεν μπορεί να ανιχνευθεί κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου.Ο αριθμός των κύκλων που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της βασικής γραμμής μπορεί να ποικίλλει και μπορεί να χρειαστεί να μειωθεί εάν χρησιμοποιούνται υψηλές ποσότητες υποδείγματος ή εάν το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου στόχου είναι υψηλό.

Η ρύθμιση της γραμμής βάσης απαιτεί την προβολή δεδομένων φθορισμού από την καμπύλη ενίσχυσης γραμμικότητας.Η γραμμή βάσης ρυθμίζεται έτσι ώστε η ανάπτυξη της καμπύλης ενίσχυσης να ξεκινά με έναν αριθμό κύκλου μεγαλύτερο από τον κορυφαίο αριθμό του βασικού κύκλου.Οι βασικές γραμμές πρέπει να ορίζονται ξεχωριστά για κάθε ακολουθία στόχου.Οι μέσες τιμές φθορισμού που ανιχνεύονται στους πρώιμους κύκλους πρέπει να αφαιρεθούν από τις τιμές φθορισμού που λαμβάνονται στα ενισχυμένα προϊόντα.Οι πιο πρόσφατες εκδόσεις διαφόρων λογισμικών PCR σε πραγματικό χρόνο επιτρέπουν την αυτόματη βελτιστοποίηση των βασικών ρυθμίσεων για μεμονωμένα δείγματα.

Κατά τη διάρκεια των πρώτων κύκλων της αντίδρασης ενίσχυσης PCR, το σήμα φθορισμού δεν αλλάζει πολύ.Η προσέγγιση μιας ευθείας γραμμής ονομάζεται γραμμή βάσης, αλλά αν κοιτάξουμε προσεκτικά τους πρώτους κύκλους, βλέπουμε ότι εντός της γραμμής βάσης είναι αυτό που συμβαίνει στην παρακάτω εικόνα.

Το Background Background αναφέρεται σε
η μη ειδική τιμή φθορισμού στην αντίδραση.Για παράδειγμα: αναποτελεσματική απόσβεση φθορισμού.ή μεγάλος αριθμός προτύπων δίκλωνου DNA λόγω της χρήσης SYBR Green.Τα στοιχεία φόντου του σήματος αφαιρούνται μαθηματικά από τον αλγόριθμο λογισμικού PCR σε πραγματικό χρόνο.

Σήμα ρεπόρτερ
Το σήμα αναφοράς αναφέρεται στο φθορίζον σήμα που παράγεται από ανιχνευτές SYBR Green ή σημασμένους με φθορισμό ειδικούς για αλληλουχία κατά τη διάρκεια της PCR σε πραγματικό χρόνο.

Κανονικό σήμα αναφοράς (RN)
Το RN αναφέρεται στην ένταση φθορισμού της βαφής αναφοράς διαιρεμένη με την ένταση φθορισμού της παθητικής βαφής αναφοράς που μετράται σε κάθε κύκλο.

Παθητική Βαφή Αναφοράς
Σε ορισμένες PCR πραγματικού χρόνου,η φθορίζουσα βαφή ROX χρησιμοποιείται ως εσωτερική αναφορά για την ομαλοποίηση του φθορίζοντος σήματος.Διορθώνει τις παραλλαγές που οφείλονται σε ανακριβείς διακυμάνσεις με πιπέτα, θέση φρέατος και διακυμάνσεις φθορισμού ανά φρεάτιο.

Το κατώφλι φθορισμού (κατώφλι)
προσαρμόστηκε πάνω από την τιμή φόντου και σημαντικά κάτω από την τιμή πλατώ της καμπύλης ενίσχυσης.Πρέπει να βρίσκεται στη γραμμική περιοχή της καμπύλης ενίσχυσης, αντιπροσωπεύοντας το λογαριθμικό-γραμμικό εύρος ανίχνευσης PCR.Τα κατώφλια πρέπει να ορίζονται στην προβολή καμπύλης λογαριθμικής ενίσχυσης, έτσι ώστε η λογαριθμική-γραμμική φάση της PCR να είναι εύκολα αναγνωρίσιμη.Εάν υπάρχουν πολλά γονίδια-στόχοι στην PCR σε πραγματικό χρόνο, το όριο πρέπει να οριστεί για κάθε στόχο.Γενικά, το σήμα φθορισμού των πρώτων 15 κύκλων της αντίδρασης PCR χρησιμοποιείται ως σήμα υποβάθρου φθορισμού, και το κατώφλι φθορισμού είναι 10 φορές η τυπική απόκλιση του σήματος φθορισμού των πρώτων 3 έως 15 κύκλων PCR, και η ρυθμισμένη εκ νέου φθορισμός φάσης της PCR είναι η εκ νέου ρύθμιση του φθορισμού.Γενικά, κάθε όργανο έχει οριστεί το όριο φθορισμού του πριν από τη χρήση.

Κατώφλι κύκλου (CT) ή Σημείο διέλευσης (CP)
Ο κύκλος στον οποίο η καμπύλη ενίσχυσης διασχίζει το κατώφλι (δηλαδή, το σημείο στο οποίο η ανίχνευση φθορισμού αυξάνεται σημαντικά).Η αξονική τομογραφία μπορεί να είναι ένα κλάσμα και η ποσότητα του αρχικού προτύπου μπορεί να υπολογιστεί.Η τιμή CT αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κύκλων που βιώνονται όταν το σήμα φθορισμού σε κάθε σωλήνα αντίδρασης PCR φθάνει το καθορισμένο όριο.Υπάρχει μια γραμμική σχέση μεταξύ της τιμής CT κάθε προτύπου και του λογάριθμου του αρχικού αριθμού αντιγράφου του προτύπου, τουυψηλότερος ο αρχικός αριθμός αντιγράφου, τόσο μικρότερη είναι η τιμή CT και αντίστροφα.Μια τυπική καμπύλη μπορεί να κατασκευαστεί χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο με γνωστό αρχικό αριθμό αντιγράφου, όπου η τετμημένη αντιπροσωπεύει την τιμή CT και η τεταγμένη αντιπροσωπεύει τον λογάριθμο του αρχικού αριθμού αντιγράφου.Επομένως, εφόσον λαμβάνεται η τιμή CT του άγνωστου δείγματος, ο αρχικός αριθμός αντιγράφου του δείγματος μπορεί να υπολογιστεί από την τυπική καμπύλη.

Τιμή ΔCT
Η τιμή ΔCT περιγράφειτη διαφορά μεταξύ του γονιδίου στόχου και της αντίστοιχης ενδογενούς τιμής CT γονιδίου αναφοράς, όπως ένα γονίδιο housekeeping, και χρησιμοποιείται για την κανονικοποίηση της ποσότητας του προτύπου που χρησιμοποιείται:
⇒ΔCT = CT (γονίδιο στόχος) – CT (ενδογενές γονίδιο αναφοράς)

Τιμή ΔΔCT
Η τιμή ΔΔCT περιγράφει τη διαφορά μεταξύ της μέσης τιμής ΔΔCT ενός δείγματος ενδιαφέροντος (π.χ. διεγερμένα κύτταρα) και της μέσης τιμής ΔΔCT ενός δείγματος αναφοράς (π.χ. μη διεγερμένα κύτταρα).Το δείγμα αναφοράς ονομάζεται επίσης δείγμα βαθμονόμησης και όλα τα άλλα δείγματα κανονικοποιούνται σε αυτό για σχετική ποσοτικοποίηση:
⇒ΔΔCT = μέσος όρος ΔCT (δείγμα ενδιαφέροντος) – μέσος όρος ΔCT (δείγμα αναφοράς)

Ενδογενή γονίδια αναφοράς (ενδογενή γονίδια αναφοράς)
Τα επίπεδα έκφρασης των ενδογενών γονιδίων αναφοράς, όπως τα γονίδια νοικοκυριού (housekeeping genes), δεν διαφέρουν μεταξύ των δειγμάτων.Η σύγκριση των τιμών CT του γονιδίου αναφοράς με το γονίδιο στόχο επιτρέπει το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου στόχου να κανονικοποιηθεί στην ποσότητα του εισερχόμενου RNA ή cDNA (δείτε την ενότητα για τις τιμές ΔCT παραπάνω).

Τα εσωτερικά γονίδια αναφοράς διορθώνονται γιαπιθανή αποικοδόμηση RNA ή παρουσία αναστολέων ενζύμου σε δείγματα RNA, καθώς και διακυμάνσεις στην περιεκτικότητα σε RNA, αποτελεσματικότητα αντίστροφης μεταγραφής, ανάκτηση νουκλεϊκού οξέος και χειρισμός δειγμάτων.Για να επιλέξουμε τα βέλτιστα γονίδια αναφοράς, τροποποιήσαμε τον αλγόριθμο για να επιτρέψουμε την επιλογή της βέλτιστης αναφοράς ανάλογα με την πειραματική ρύθμιση.

Εσωτερικός έλεγχος
Μια αλληλουχία ελέγχου που ενισχύεται στην ίδια αντίδραση με την αλληλουχία στόχο και ανιχνεύεται με διαφορετικό ανιχνευτή (δηλαδή, διεξαγωγή διπλής PCR).Οι εσωτερικοί έλεγχοι χρησιμοποιούνται συχνά για τον αποκλεισμό αποτυχημένων ενισχύσεων, όπως όταν δεν ανιχνεύεται η αλληλουχία στόχου.
Δείγμα βαθμονόμησης
Ένα δείγμα αναφοράς (για παράδειγμα, καθαρισμένο RNA από μια κυτταρική σειρά ή ιστό) που χρησιμοποιείται σε σχετική ποσοτικοποίηση για τη σύγκριση όλων των άλλων δειγμάτων για τον προσδιορισμό του σχετικού επιπέδου έκφρασης ενός γονιδίου.Το δείγμα βαθμονόμησης μπορεί να είναι οποιοδήποτε δείγμα, αλλά είναι συνήθως έλεγχος (για παράδειγμα, δείγμα χωρίς επεξεργασία ή δείγμα από το χρόνο μηδέν του πειράματος).

Θετικοί έλεγχοι
χρησιμοποιήστε αντιδράσεις ελέγχου μεγνωστές ποσότητες προτύπου.Συχνά χρησιμοποιούνται θετικοί έλεγχοι για να ελεγχθεί ότι ένα σετ εκκινητών ή σετ εκκινητών-ανιχνευτών λειτουργεί σωστά και ότι η αντίδραση έχει ρυθμιστεί σωστά.

Χωρίς έλεγχο προτύπου (NTC)
Μια αντίδραση ελέγχου που περιέχει όλα τα απαραίτητα συστατικά της αντίδρασης ενίσχυσης εκτός από το εκμαγείο, το οποίο συνήθως αντικαθίσταται με νερό.Η χρήση του NTC μπορεί να εντοπίσει τη μόλυνση που προκαλείται από μόλυνση από αντιδραστήρια ή ξένο DNA, διασφαλίζοντας έτσι την αυθεντικότητα και την αξιοπιστία των δεδομένων ανίχνευσης.Η ενίσχυση του ελέγχου NTC υποδηλώνει μόλυνση.

Χωρίς έλεγχο RT (NRT)
Η διαδικασία εξαγωγής RNA μπορεί να περιέχει υπολειμματικό γονιδιωματικό DNA, το οποίο είναι εξαιρετικά επιβλαβές και είναι ο ένοχος που επηρεάζει την ποιότητα των δεδομένων και ο φυσικός εχθρός του qPCR, επομένως κατά το σχεδιασμό πειραμάτων, πρέπει να σχεδιάζεται μόνο για να ενισχύει την ανίχνευση RNA.Υπάρχουν δύο τρόποι, ο ένας είναι ο σχεδιασμός εκκινητών κατά μήκος των εσωνίων, ο άλλος είναι η πλήρης αφαίρεση του DNA, ποιος είναι καλύτερος, ο οποίος θα συζητηθεί αργότερα.Ο έλεγχος NTR είναι ένας μαγικός καθρέφτης για την ανίχνευση της ρύπανσης του DNA.Αν υπάρχει ενίσχυση, σημαίνει ότι υπάρχει ρύπανση.

Πρότυπα
Τα πρότυπα είναι δείγματα γνωστής συγκέντρωσης ή αριθμού αντιγράφων που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή μιας πρότυπης καμπύλης.Προκειμένου να εξασφαλιστεί η σταθερότητα του προτύπου, το θραύσμα γονιδίου συνήθως κλωνοποιείται στο πλασμίδιο και χρησιμοποιείται ως πρότυπο.

Η τυπική καμπύλη
συνήθως αραιώνεται σε τουλάχιστον 5 βαθμίδες συγκέντρωσης με το πρότυπο προϊόν σύμφωνα με την αναλογία διπλασιασμού, και 5 σημεία σχεδιάζονται στις συντεταγμένες της τιμής CT και του αριθμού αντιγράφου και τα σημεία συνδέονται για να σχηματίσουν μια γραμμή για να δημιουργήσουν μια τυπική καμπύλη.Για κάθε τυπική καμπύλη, πρέπει να ελέγχεται η εγκυρότητά της.Η τιμή της κλίσης κυμαίνεται μεταξύ –3,3 και –3,8 και κάθε συγκέντρωση εκτελείται εις τριπλούν.Σημεία που διαφέρουν σημαντικά από άλλα σημεία θα πρέπει να απορριφθούν.Η τιμή CT του προς δοκιμή δείγματος εισάγεται στην τυπική καμπύλη και μπορεί να υπολογιστεί το επίπεδο έκφρασης του προς δοκιμή δείγματος.

Η τιμή CT του προς δοκιμή δείγματος εισάγεται στην τυπική καμπύλη και μπορεί να υπολογιστεί ο αρχικός αριθμός αντιγράφου του προς δοκιμή δείγματος.

Αποδοτικότητα και κλίση
Η κλίση της τυπικής καμπύλης αντιπροσωπεύει την αποτελεσματικότητα της PCR σε πραγματικό χρόνο.
·Μια κλίση -3,322 υποδεικνύει ότι η απόδοση ενίσχυσης PCR είναι 1 ή 100% αποτελεσματική και η ποσότητα του προϊόντος PCR διπλασιάζεται σε κάθε κύκλο.
·Κλίση μικρότερη από –3.322 (π.χ. –3.8) υποδηλώνει αποτελεσματικότητα PCR
·Μια κλίση μεγαλύτερη από –3.322 (π.χ. –3.0) υποδηλώνει ότι η αποτελεσματικότητα της PCR φαίνεται να είναι μεγαλύτερη από 100%, κάτι που είναι περίεργο, πώς θα μπορούσε ένας κύκλος PCR να δημιουργήσει περισσότερο από το διπλάσιο του ενισχυμένου προϊόντος;Αυτή η κατάσταση εμφανίζεται στη μη γραμμική φάση της αντίδρασης PCR, δηλαδή υπάρχει μεγάλη ποσότητα μη ειδικής ενίσχυσης.

καμπύλη τήξης
Αφού ολοκληρωθεί η ενίσχυση qPCR, το προϊόν PCR θερμαίνεται.Καθώς η θερμοκρασία αυξάνεται, το δίκλωνο προϊόν ενίσχυσης λιώνει σταδιακά, με αποτέλεσμα τη μείωση της έντασης φθορισμού.Όταν επιτευχθεί μια ορισμένη θερμοκρασία (Tm), ένας μεγάλος αριθμός προϊόντων θα λιώσει.Ο φθορισμός πέφτει απότομα.Διαφορετικά προϊόντα PCR έχουν διαφορετικές τιμές Tm και διαφορετικές θερμοκρασίες τήξης, έτσι ώστε να μπορεί να προσδιοριστεί η ειδικότητα της PCR.

Καμπύλη τήξης (παράγωγη καμπύλη)
Η καμπύλη τήξης προκύπτει για να σχηματίσει έναν χάρτη κορυφής, ο οποίος μπορεί να εμφανίσει πιο διαισθητικά την κατάσταση των θραυσμάτων του προϊόντος PCR.Δεδομένου ότι η θερμοκρασία τήξης είναι η τιμή Tm του θραύσματος DNA, ορισμένες παράμετροι που επηρεάζουν την τιμή Tm του θραύσματος DNA μπορούν να κριθούν, όπως το μέγεθος του θραύσματος, η περιεκτικότητα σε GC κ.λπ. Γενικά, σύμφωνα με τις αρχές σχεδιασμού εκκινητών μας,το μήκος του ενισχυμένου προϊόντος κυμαίνεται από 80-300bp, επομένως η θερμοκρασία τήξης πρέπει να είναι μεταξύ 80°C και 90°C.

Ερμηνεία της καμπύλης τήξης: Εάν η μόνη κύρια κορυφή εμφανίζεται μεταξύ 80°C-90°C, σημαίνει ότι η φθορίζουσα ποσοτική PCR είναι τέλεια.εάν η κύρια κορυφή εμφανίζεται μεταξύ 80°C-90°C και διάφορες κορυφές εμφανίζονται κάτω από τους 80°C, το διμερές εκκινητή βασικά λαμβάνεται υπόψη.Μπορείτε να προσπαθήσετε να αυξήσετε τη θερμοκρασία ανόπτησης για να το λύσετε.εάν η κύρια κορυφή εμφανίζεται μεταξύ 80°C-90°C και η διάφορη κορυφή εμφανίζεται ξανά όταν αυξάνεται η θερμοκρασία, βασικά θεωρείται ότι υπάρχει μόλυνση του DNA και το DNA πρέπει να αφαιρεθεί στο αρχικό στάδιο του πειράματος.

Φυσικά, υπάρχουν ακόμα κάποιες μη φυσιολογικές καταστάσεις, οι οποίες θα αναλυθούν μία προς μία παρακάτω.
3. Προχωρημένες γνώσεις

Για να κάνω qPCR, πρέπει να πω MIQE,Ελάχιστες πληροφορίεςγια Δημοσίευση τουΠοσοτικόςPCR σε πραγματικό χρόνοΠειράματα —οι ελάχιστες πληροφορίες για τη δημοσίευση άρθρων σχετικά με την ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνοπειράματα.Για να απλοποιήσουμε την κατανόηση όλων, θα απλοποιήσουμε το βασικό περιεχόμενο.

Μπορείτε να αναζητήσετε το αρχικό κείμενο του MIQE στο Διαδίκτυο και το πιο σημαντικό είναι ότι ορίζειλίστα ελέγχου δεδομένων που πρέπει να παρέχεται κατά τη δημοσίευση ενός άρθρου .

Οι αναθεωρητές μπορούν να κρίνουν την ποιότητα του πειράματος διαβάζοντας αυτές τις λεπτομέρειες.Οι μελλοντικοί αναγνώστες μπορούν επίσης να το χρησιμοποιήσουν για να επαναλάβουν ή να βελτιώσουν το πείραμα.
Αξίζει να σημειωθεί ότι στη λίστα αυτή η σημασία της κάθε λίστας σημειώνεται με Ε ή Δ αντίστοιχα.Τι σημαίνει?Ε: βασικές πληροφορίες (πρέπει να υποβληθούν).Δ: επιθυμητές πληροφορίες (παρέχετε όσο το δυνατόν περισσότερες).

MIQE (1)—Πειραματικός σχεδιασμός
Πολλοί βρωμόκοι που έχουν ολοκληρώσει την υπεράσπισή τους αφού τελειώσουν τις μεταπτυχιακές τους σπουδές δεν θα ξέρουν πώς να σχεδιάσουν ένα πείραμα ανεξάρτητα, να ανοίξουν τα τετράδιά τους και να κάνουν ό,τι τους λέει ο δάσκαλος.Ως αποτέλεσμα, ο πειραματικός σχεδιασμός δεν ήταν αυστηρός, και το συντακτικό τμήμα του περιοδικού είπε ότι ήθελαν να φτιάξουν αυτή την εικόνα και εκείνη την εικόνα, οπότε το έκαναν ζαλισμένοι.Ετσι φτιάχνονται τα σκουπίδια!

Πιο κοντά στο σπίτι, η πρώτη αρχή του πειράματος είναι να προσδιοριστείη αυστηρότητα της πειραματικής λογικής.Το πιο θεμελιώδες πράγμα είναι ο πειραματικός σχεδιασμός και το πιο σημαντικό πράγμα σχετικά με τον πειραματικό σχεδιασμό είναι πώς να ορίσετε το δείγμα-στόχο, το δείγμα αναφοράς (έλεγχος) και τον αριθμό των επαναλήψεων, έτσι ώστε τα πειραματικά δεδομένα να μπορούν να αναφέρονται, να είναι συγκρίσιμα και πειστικά.

Το δείγμα στόχοςαναφέρεται στο δείγμα που απαιτεί να ανιχνεύσουμε το γονίδιο στόχο μετά από μια συγκεκριμένη θεραπεία.Το δείγμα αναφοράςείναι το δείγμα χωρίς καμία επεξεργασία, το οποίο αναφέρεται συχνά ως άγριος τύπος στη βιολογία.

Πειραματικά αντίγραφαείναι πολύ σημαντικές.Γενικά, ο αριθμός των πειστικών επαναλήψεων πρέπει να είναι μεγαλύτερος από τρεις.Είναι απαραίτητο να διακρίνουμε τι είναι η βιολογική αναπαραγωγή και τι είναι η τεχνική αντιγραφή.

Βιολογικά Αντίγραφα: Το ίδιο πείραμα επαλήθευσης που έγινε με διαφορετικά υλικά (χρόνος, φυτά, παρτίδες, πλάκες αντίδρασης).

Βιολογικός διπλασιασμός
Ας πάρουμε ως παράδειγμα τη θεραπεία με φυτοφάρμακα του πιπεριού.Θέλουμε να ψεκάσουμε φυτοφάρμακα στα τρία φυτά του ABC, τότε τα τρία φυτά του ABC είναι τρία βιολογικά αντίγραφα και είναι το ίδιο πείραμα επαλήθευσης που πραγματοποιήθηκε με διαφορετικά υλικά.Αλλά ως πείραμα, χρειάζεται οπωσδήποτε έλεγχος, οπότε μπορούμε να ψεκάσουμε έναν από τους κλάδους του φυτού Α για να σχηματίσουμε μια πειραματική ομάδα του φυτού Α και να μην ψεκάσουμε τους άλλους κλάδους του φυτού Α για να σχηματίσουμε μια ομάδα ελέγχου.Κάντε το ίδιο για το Β και το Γ.

Τεχνικά αντίγραφα (Τεχνικά αντίγραφα): Είναι ένα επαναλαμβανόμενο πείραμα που έχει σχεδιαστεί για την αποφυγή σφαλμάτων που προκαλούνται από τη λειτουργία, η οποία είναι στην πραγματικότητα μια διπλή τρύπα που περιλαμβάνεται στο ίδιο υλικό.Τόσο οι θεραπείες όσο και οι μάρτυρες πρέπει να έχουν επαναλαμβανόμενες ρυθμίσεις (τουλάχιστον τρεις) του γονιδίου στόχου και του εσωτερικού γονιδίου αναφοράς.

Τεχνική επανάληψη
Πάρτε πάλι ως παράδειγμα την πιπεριά που έχει υποστεί επεξεργασία με φυτοφάρμακα.Για την πειραματική ομάδα του φυτού Α, κάναμε τρεις οπές PCR των 1, 2 και 3 για το γονίδιο στόχο και το εσωτερικό γονίδιο αναφοράς αντίστοιχα, έτσι ώστε να λαμβάνεται ο μέσος όρος μετά την ανίχνευση.Για τον έλεγχο του φυτού Α οι ομάδες αντιμετωπίζονται επίσης με τον ίδιο τρόπο.Ομοίως, κάντε την ίδια θεραπεία για τα φυτά Β και Γ.Αυτή είναι τεχνική επανάληψη.

Αξίζει να σημειωθεί ότιΑυτό που μπαίνει στα στατιστικά είναι η βιολογική επανάληψη και η τεχνική επανάληψη είναι να ελέγξουμε αν υπάρχουν τυχαία φαινόμενα στην πειραματική διαδικασία, ώστε να γίνουν τα πειραματικά αποτελέσματα αξιόπιστα, δηλαδή να αποφευχθούν λάθη παίρνοντας τον μέσο όρο τους όπως λέμε συχνά.

Αρνητικά στοιχεία ελέγχου—NTC και NRT
NTC (Έλεγχος χωρίς πρότυπο), ένας έλεγχος χωρίς πρότυπο, χρησιμοποιείται για να επαληθευτεί εάν το πειραματικό υλικό είναι μολυσμένο.Γενικά, το νερό χρησιμοποιείται ως πρότυπο.Εάν υπάρχει αντίδραση φθορισμού, υποδηλώνει ότι έχει συμβεί μόλυνση με νουκλεϊκό οξύ στο εργαστήριο.

Αυτές οι ρύπανση προέρχονται από: ακάθαρτο νερό, μη εγκεκριμένα αντιδραστήρια που περιέχουν ενδογενές DNA, ρύπανση από εκκινητές, ρύπανση εργαστηριακού εξοπλισμού, ρύπανση από αεροζόλ κ.λπ., ανάγκη χρήσης σαρωτών RNase και αναστολέων RNase.Η ρύπανση από αεροζόλ είναι το πιο δύσκολο να βρεθεί.Φανταστείτε το εργαστήριό σας είναι σαν αιθαλομίχλη, με διάφορα νουκλεϊκά οξέα αιωρούμενα στον αέρα.

NRT (χωρίς ανάστροφη μεταγραφάση), ο έλεγχος χωρίς αντίστροφη μεταγραφή, είναι το μη ανάστροφο μεταγραφόμενο RNA ως αρνητικός έλεγχος, που είναι ο έλεγχος του υπολείμματος gDNA.

Όταν γίνεται έκφραση γονιδίου, η ποσότητα του RNA ανιχνεύεται ανιχνεύοντας την ποσότητα του cDNA μετά την αντίστροφη μεταγραφή.Εάν υπάρχει υπόλειμμα gDNA όταν το RNA καθαρίζεται, θα προκαλέσει σφάλματα στα πειραματικά αποτελέσματα, επειδή τα πραγματικά αποτελέσματα που λαμβάνονται είναι gDNA και cDNA.Σε επίπεδο συσσωματώματος, όχι μόνο cDNA, το gDNA πρέπει να αφαιρεθεί πλήρως κατά την εκχύλιση RNA.

MIQE (2) — δείγμα πληροφοριών
Το λεγόμενο δείγμα πληροφοριών σημαίνει ότι όταν δημοσιεύουμε ένα άρθρο σχετικά με το qPCR, πρέπει να εξηγούμε με σαφήνεια το δείγμα πληροφοριών, το οποίο είναι απαραίτητο μέρος του άρθρου.Ομοίως, όταν επεξεργαζόμαστε δείγματα, πρέπει επίσης να ρυθμίζουμε τις δικές μας λειτουργίες για να διασφαλίσουμε την εγκυρότητα των δειγμάτων.

Η περιγραφή του δείγματος είναι μόνο ένα αποτέλεσμα και θα πρέπει να δώσουμε μεγαλύτερη προσοχή στα υλικά που λαμβάνονται κατά τη διάρκεια ολόκληρου του πειράματος.

Επιλογή πειραματικών υλικών
Δείγματα αίματος – επιλέξτε φρέσκο ​​αίμα, όχι περισσότερο από 4 ώρες.Δείγματα κυττάρων – επιλέξτε να συλλέξετε φρέσκα κύτταρα σε μια περίοδο έντονης ανάπτυξης.Ζωικός ιστός—Επιλέξτε φρέσκο, δυναμικά αναπτυσσόμενο ιστό.Φυτικός ιστός – Επιλέξτε φρέσκο, νεαρό ιστό.

Πρέπει να έχετε παρατηρήσει ότι υπάρχει μια λέξη κλειδί σε αυτές τις λίγες προτάσεις: φρέσκο ​​.
Για τα παραπάνω δείγματα, το καλύτερο, οικονομικό και σταθερό κιτ στην αγορά είναι το κιτ της Foregene, το οποίο μπορεί γρήγορα και εύκολα να εξαγάγει το DNA και το RNA τους.

Μίνι κιτ DNA αίματος

Κιτ απομόνωσης ολικού RNA κυττάρων

Animal Total RNA Isolation Kit

Κιτ απομόνωσης ολικού RNA φυτού

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Κιτ απομόνωσης DNA φυτού

Αποθήκευση πειραματικών υλικών
Σε γενικές γραμμές, δεν συνιστούμε την αποθήκευση δειγμάτων, εάν το επιτρέπουν οι συνθήκες.Ωστόσο, υπάρχουν πολλοί φίλοι που δεν μπορούν να πραγματοποιήσουν πειράματα αμέσως μετά τη δειγματοληψία και μερικοί χρειάζονται ακόμη και να μεταφέρουν δεξαμενές υγρού αζώτου στο χωράφι για δειγματοληψία.

Για αυτόν τον σκληρά εργαζόμενο φίλο, μπορώ μόνο να πω ότι δεν καταλαβαίνεις τα αναλώσιμα αντιδραστηρίων.Τώρα πολλές εταιρείες αναλώσιμων αντιδραστηρίων παράγουν αντιδραστήρια που μπορούν να αποθηκεύσουν δείγματα RNA σε θερμοκρασία δωματίου και μπορείτε να επιλέξετε να τα χρησιμοποιήσετε.Η συμβατική μέθοδος αποθήκευσης είναι η αποθήκευση υγρού αζώτου, χρησιμοποιώντας μια μικρή δεξαμενή υγρού αζώτου που είναι εύκολη στη μεταφορά.Αφού φέρετε το δείγμα πίσω στο εργαστήριο, αποθηκεύστε το σε ψυγείο -80°C.

Για πειράματα που περιλαμβάνουν RNA, πρέπει να ακολουθείται η αρχή των έξι λέξεων:χαμηλή θερμοκρασία, χωρίς ένζυμα,καιγρήγορα .

Η έννοια της χαμηλής θερμοκρασίας είναι εύκολα κατανοητή.Χωρίς ένζυμα, η RNase υπάρχει παντού στον κόσμο που ζούμε (διαφορετικά θα είχατε σκοτωθεί από τον ιό HIV), οπότε πώς να αποφύγετε τη RNase όταν κάνετε πειράματα είναι μια πολύ σημαντική ιδέα.γρήγορα,Δεν υπάρχει Κουνγκ Φου στον κόσμο που δεν μπορεί να σπάσει, μόνο η ταχύτητα δεν μπορεί να σπάσει.

Επομένως, κατά μία έννοια, όσο μικρότερος είναι ο χρόνος εξαγωγής, τόσο καλύτερο είναι το κιτ.ΓιατίForegeneΤο κιτ του δίνει έμφαση στην ταχύτητα, γιατί το ξέρουν καλά.

ΥΓ: Κάποια κορίτσια κάνουν πειράματα πολύ προσεκτικά, αλλά δεν είναι τόσο καλά όσο ένα slam dunk μετά από αρκετά χρόνια δουλειάς.Νιώθουν ότι ο Θεός είναι άδικος, παραπονιέται για τους άλλους και ψάχνει για ζωή.Στην πραγματικότητα, δεν το κατάλαβε.Δεν προστάτευε καλά το RNA και ο παίκτης του slam dunk ήταν ευκίνητος.Όταν έκανε το πείραμα, νόμιζε ότι θα τελείωνε το slam dunk με τρεις φορές, πέντε φορές και δύο διαιρέσεις, αλλά το έκανε καλά το πείραμα.

Σημείωση: Πιο αργά, περισσότερες πιθανότητες εισβολής RNase.Πώς να εκπαιδεύσετε τον εαυτό σας να είναι γρήγορος;Δεν υπάρχει τρόπος, απλά εξασκηθείτε περισσότερο.

Για διαφορετικά πειράματα και διαφορετικά δείγματα, είναι ακόμα απαραίτητο να διαβάσετε περισσότερη βιβλιογραφία και να επιλέξετε μια κατάλληλη μέθοδο επεξεργασίας.Για τη διαδικασία συλλογής και αποθήκευσης δειγμάτων, το MIQE απαιτεί να είναι καθαρά γραμμένο στο χαρτί, έτσι ώστε οι κριτές να μπορούν να ελέγξουν την αξιοπιστία του χαρτιού και είναι επίσης βολικό για τους έκπληκτους νέους να επαναλάβουν το πείραμά σας.

Αν και τα βιολογικά πειράματα είναι δύσκολα, είναι υψηλού επιπέδου.Αν δεν προσέξεις, μπορείς να ανατρέψεις τον κόσμο.Για παράδειγμα, μετατρέποντας το SARS σε βιοχημική κρίση ή κάνοντας υβριδικό ρύζι για να σωθούν 1,3 δισεκατομμύρια άνθρωποι.Η παρακάτω εικόνα είναι ένα χημικό πείραμα, θα πρέπει να καταλάβετε πόσο περήφανοι είστε για την έρευνά σας κοιτάζοντας μόνο την εμφάνισή του που μοιάζει με πουλί.Ξέχνα το, μην τον μαυρίσεις.

MIQE (3) – εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος.
Η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος είναι ένα μεγάλο γεγονός και όλα τα πειράματα μοριακής βιολογίας ξεκινούν με την εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος.Πρώτα απ 'όλα, ας αντιγράψουμε το περιεχόμενο του MIQE για την εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος.

Κοιτάζοντας αυτή τη φόρμα, δεν μπορείτε να μείνετε στην επιφάνεια.Η μορφή είναι δόγμα.Για να είσαι κορυφαίος μαθητής, πρέπει να ρωτήσεις γιατί.Το βασικό περιεχόμενο αυτού του πίνακα είναι: Επιδίωξητην καθαρότητα, την ακεραιότητα, τη συνοχή και την ποσότητα εκχύλισης του RNA .

Το πρώτο μέρος τουδιαδικασία ή όργανο είναι το βήμα εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος.Εάν χρησιμοποιείτε αυτόματο εξαγωγέα νουκλεϊκού οξέος για εξαγωγή (για προχωρημένους, επικοινωνήστε μαζί μου για αγορά), πρέπει να αναφέρετε το όνομα μοντέλου του οργάνου.

Το όνομα του κιτ και

Το κιτ που χρησιμοποιήθηκε για τις λεπτομέρειες της αλλαγής, ποια ειδικά αντιδραστήρια προστέθηκαν ή ποιες ειδικές λειτουργίες έγιναν θα πρέπει να εξηγηθεί με σαφήνεια, ώστε οι άλλοι να μπορούν εύκολα να επαναλάβουν το πείραμά σας.

Μερικοί άνθρωποι προσθέτουν κάποια ειδικά αντιδραστήρια κατά την εξαγωγή ειδικών δειγμάτων, νομίζοντας ότι αυτό είναι το μυστικό τους όπλο και δεν το λένε σε άλλους.Ενώ το κρατούν μυστικό, χάνουν επίσης την ευκαιρία να κάνουν το άρθρο σας να λάμψει.Μην είσαι έξυπνος, πρέπει να είσαι πιο ειλικρινής από τον παλιό Zhang στην επιστημονική έρευνα, αν θέλεις να είσαι έξυπνος, το άρθρο θα σε κάνει ανόητο.

πρέπει να θυμάστε τον αριθμό προϊόντος του κιτόταν παραγγείλετε το κιτ και γράφετε το άρθρο .Υπάρχουν γενικά δύο αριθμοί στο κιτ: Cat—αριθμός καταλόγου (αριθμός προϊόντος, αριθμός προϊόντος), Παρτίδα— αριθμός παρτίδας προϊόντος ( Χρησιμοποιείται για να υποδείξει από ποια παρτίδα προήλθε το προϊόν).

Επιπλέον, ο αριθμός CAS χρησιμοποιείται συχνά κατά την παραγγελία βιοχημικών αντιδραστηρίων και θα τον εκλαϊκεύσω μαζί.Ο αριθμός CAS είναι ο αριθμός που δίνει η Αμερικανική Χημική Εταιρεία σε κάθε νέο χημικό φάρμακο.Γενικά, τρεις αριθμοί συνδέονται με μια παύλα.Αριθμός CAS του Rushui: 7732-18-5.Τα χημικά έχουν συχνά πολλαπλά ψευδώνυμα, αλλά ο αριθμός CAS είναι μοναδικός.Όταν παραγγέλνετε φάρμακο, μπορείτε να ελέγξετε πρώτα τον αριθμό CAS του.

Πιο κοντά στο σπίτι, γιατί πρέπει να περιγράψουμε αυτά τα πράγματα ξεκάθαρα;Στην πραγματικότητα, είναι επίσης ο έλεγχος της ποιότητας της εξαγωγής RNA.Η χρήση οργάνων και κιτ θα κάνει την εξαγωγή RNA πιο συνεπή.Η κλίμακα εξαγωγής των συνηθισμένων εργαστηρίων δεν είναι μεγάλη και μπορεί να ληφθεί με κιτ.

Οι λεπτομέρειες της θεραπείας με DNase ή RNase
Το σημαντικό ζήτημα της φθορίζουσας ποσοτικής PCR είναι η πρόληψη της μόλυνσης του DNA και μην πειραματιστείτε εάν υπάρχει μόλυνση.Επομένως, είναι επιτακτική ανάγκη να δηλώσετε τη διαδικασία που χρησιμοποιήσατε για την επεξεργασία του DNA, προκειμένου να αποδείξετε ότι το DNA στην πειραματική διαδικασία έχει αφαιρεθεί πλήρως και πλήρως.αντιπροσωπεύεται από ένα σχηματικό διάγραμμα.

Σχηματικό διάγραμμα RNA και DNA
Γενικά, η μέθοδος για την αφαίρεση του DNA είναι η επεξεργασία του RNA με DNase μετά την εκχύλιση.Ωστόσο, αυτές είναι σχετικά παλιές μέθοδοι.Τα εμπορικά κιτ εξαγωγής RNA μπόρεσαν να αφαιρέσουν το DNA κατά τη διάρκεια της διαδικασίας εκχύλισης χωρίς προσθήκη DNase.Για παράδειγμα, μια σειρά κιτ από την Foregene.

Σημείωση: Η αφαίρεση του DNA κατά την εξαγωγή RNA είναι ένα πολύ επικίνδυνο δίκοπο μαχαίρι, το οποίο θα παρατείνει το χρόνο λειτουργίας της εξαγωγής RNA και θα αυξήσει τον κίνδυνο αποικοδόμησης του RNA.Βασικά, είναι μια αντιστάθμιση μεταξύ της απόδοσης RNA και της καθαρότητας.

Επιπλέον, η ποσότητα DNase που προστίθεται στη στήλη προσρόφησης με βάση το πυρίτιο είναι πολύ μικρή και πρέπει να χρησιμοποιηθεί DNase υψηλής ποιότητας για να επιτευχθεί το αποτέλεσμα.Η μη βελτιστοποιημένη DNase δεν μπορεί να αφομοιωθεί γρήγορα και πλήρως.Αυτή είναι μια δοκιμή του τεχνικού επιπέδου του εμπόρου.Φυσικά, υπάρχουν ακόμα πιο περίεργοι έμποροι που καυχιούνται ότι το DNA μπορεί να αφαιρεθεί χωρίς DNase.Μπορεί να ειπωθεί ότι όποιος καυχιέται ότι το DNA μπορεί να αφαιρεθεί εντελώς χωρίς DNase είναι χούλιγκαν.Το DNA είναι μια σχετικά σταθερή δίκλωνη δομή και δεν μπορεί να εξαλειφθεί μόνο μιλώντας και γελώντας.

Εκτίμηση μόλυνσης
μέθοδος αξιολόγησης: ανίχνευση ηλεκτροφόρησης, 1% αγαρόζη, 6V/cm, 15 λεπτά, φόρτωση 1-3 ul

Ποσοτική ανάλυση νουκλεϊκού οξέος
μετριέται συνήθως με χρήση φασματοφωτόμετρου UV.Επιτρέψτε μου πρώτα να δημοσιοποιήσω την έννοια των τριών τιμών των OD260, OD280 και OD230.
·OD260nm: Είναι το μήκος κύματος απορρόφησης της υψηλότερης κορυφής απορρόφησης νουκλεϊκού οξέος και η καλύτερη μετρούμενη τιμή κυμαίνεται από 0,1 έως 1,0.Εάν όχι, αραιώστε ή συμπυκνώστε το δείγμα για να το φέρετε εντός του εύρους.
·OD280nm: Είναι το μήκος κύματος απορρόφησης της υψηλότερης κορυφής απορρόφησης πρωτεϊνών και φαινολικών ουσιών.
·OD230nm: Είναι το μήκος κύματος απορρόφησης της υψηλότερης κορυφής απορρόφησης υδατανθράκων.

Στη συνέχεια, ας μιλήσουμε για το ρόλο κάθε δείκτη.Για το A260, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση της απόδοσης νουκλεϊκού οξέος.Όταν OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Για την καθαρότητα, πρέπει να δούμε τις αναλογίες που βλέπουμε συνήθως: OD260/280 και OD260/230.
·Καθαρό DNA: Το OD260/280 είναι περίπου ίσο με 1,8.Όταν είναι μεγαλύτερο από 1,9, σημαίνει ότι υπάρχει ρύπανση από RNA και όταν είναι μικρότερο από 1,6, σημαίνει ότι υπάρχει ρύπανση από πρωτεΐνες και φαινόλη.
·Καθαρό RNA: 1,7
·OD260/230: Είτε πρόκειται για DNA είτε για RNA, η τιμή αναφοράς είναι 2,5.Όταν είναι μικρότερο από 2,0, υποδηλώνει ότι υπάρχει ρύπανση από ζάχαρη, αλάτι και οργανική ύλη.

ακεραιότητα RNA

Είναι πολύ σημαντικό να μετρηθεί η ακεραιότητα του RNA.Γενικά, είναι απαραίτητο να γίνει ένα πείραμα γέλης μετουσίωσης RNA για να ελεγχθεί εάν η φωτεινότητα μεταξύ 28S και 18S RNA είναι διπλή σχέση.Όταν εμφανίζεται η τρίτη ζώνη 5S, σημαίνει ότι το RNA έχει αρχίσει να αποικοδομείται, εκτός από τα ασπόνδυλα.

Δεδομένα για αξιολόγηση ποιότητας RNA: Εκτός από τις παραπάνω δοκιμές, υπάρχουν επίσης ορισμένες πιο προηγμένες δοκιμές οργάνων όσον αφορά την ακεραιότητα RNA, όπως η δοκιμή ακεραιότητας RQI του συστήματος αυτόματης ηλεκτροφόρησης Experion, που μπορεί να ανιχνεύσει εάν το RNA αποικοδομείται αόρατα.

Στην επιστημονική έρευνα, η φθορίζουσα ποσοτική PCR είναι μια σύγκριση μεταξύ του γονιδίου στόχου και του εσωτερικού γονιδίου αναφοράς.Ως εκ τούτου, στη διαδικασία της διατήρησης του δείγματος RNA, της εξαγωγής RNA κ.λπ., ο πρωταρχικός στόχος είναι να εξασφαλιστεί η ακεραιότητα του RNA.

Το πώς η ακεραιότητα του RNA επηρεάζει την ισορροπία μεταξύ του γονιδίου στόχου και του εσωτερικού γονιδίου αναφοράς μπορεί να γίνει εύκολα κατανοητό από το παρακάτω σχήμα.Η αποικοδόμηση θα οδηγήσει σε γονιδιακή ανεπάρκεια, είτε πρόκειται για την α πληρότητα του εσωτερικού γονιδίου αναφοράς είτε για την ατελή του γονιδίου στόχου, θα έχει μεγάλο αντίκτυπο στα δεδομένα.

Το σχηματικό διάγραμμα του γονιδίου στόχου και του γονιδίου αναφοράς, δεν πρέπει να είναι αληθές

Δοκιμή αναστολής (αν η τιμή CT καταστέλλεται υπό υψηλή ή χαμηλή συγκέντρωση ή άλλες συνθήκες)

Λαμβάνοντας αυτό το σχήμα ως παράδειγμα, οι τιμές Ct των πέντε καμπυλών είναι οι εξής.Η κατανομή των τιμών CT μεταξύ των καμπυλών είναι άνιση και οι τιμές Ct καθυστερούν σε υψηλές και χαμηλές συγκεντρώσεις, όπως είναι η περίπτωση της αναστολής PCR.

Σημείο κλειδί: Στη διαδικασία εξαγωγής RNA, πρέπει να εγκαταλείψουμε τις λανθασμένες αντιλήψεις και να καθορίσουμε τις σωστές.

Η λάθος ιδέα είναι: η εξαγωγή RNA επιδιώκει μόνο την απόδοση, πιστεύοντας ότι όσο μεγαλύτερη είναι η ποσότητα του RNA που λαμβάνεται, τόσο το καλύτερο.Στην πραγματικότητα, όταν κάνουμε ποσοτικοποίηση, εάν ο αριθμός των γονιδίων δεν είναι πολύ μεγάλος, δεν χρειαζόμαστε πολύ RNA.Η ποσότητα του RNA που εξάγετε είναι υπεραρκετή.

Η σωστή έννοια είναι:Η εξαγωγή RNA θα πρέπει να επιδιώκει την καθαρότητα, την ακεραιότητα και τη συνέπεια.Η καθαρότητα μπορεί να διασφαλίσει ότι η επακόλουθη αντίστροφη μεταγραφή δεν θα ανασταλεί και τα δεδομένα δεν θα επηρεαστούν από το DNA.Η ακεραιότητα διασφαλίζει την ισορροπία των αλληλουχιών στόχων και των εσωτερικών αναφορών.Η συνέπεια εξασφαλίζει σταθερή φόρτωση δείγματος.

MIQE (4) – αντίστροφη μεταγραφή
Παρανόηση: η επιδίωξη μεγαλύτερου όγκου δειγμάτων.
Σωστή έννοια: Επιδιώξτε τη συνέπεια (σταθερότητα), ανεξάρτητα από την ποσότητα του φορτωμένου RNA, η αποτελεσματικότητα της αντίστροφης μεταγραφής παραμένει σταθερή, διασφαλίζοντας ότι οι διαφορές στο cDNA μπορούν πραγματικά να αντικατοπτρίζουν τις διαφορές στο mRNA.
Εξηγούμε αυτή τη διαδικασία με ένα σχηματικό διάγραμμα:

Το σχηματικό διάγραμμα της αποτελεσματικότητας της αντίστροφης μεταγραφής, δεν είναι αληθές
Πρώτα απ 'όλα, πρέπει να κατανοήσουμε τη διαφορά μεταξύ της διαδικασίας αντίστροφης μεταγραφής και της διαδικασίας PCR.Η PCR υφίσταται πολλαπλές διεργασίες θέρμανσης και ανόπτησης και το θραύσμα στόχος αυξάνεται εκθετικά.ενώ η αντίστροφη μεταγραφή δεν έχει αυτή τη διαδικασία, μπορούμε να φανταστούμε ότι η αντίστροφη μεταγραφή είναι στην πραγματικότητα ένα προς ένα Κατά τη διαδικασία αντιγραφής, τόσα κομμάτια RNA

καθώς υπάρχουν μπορούν να λάβουν τόσα κομμάτια πληροφοριών cDNA, θα πρέπει να είναι κατανοητό μέχρι τώρα, επειδή θραύσματα μεγάλα και μικρά έχουν μεταγραφεί αντίστροφα και είναι αδύνατο να εστιάσουμε σε ένα θραύσμα.Και επειδή η ποσότητα του RNA είναι σχετικά μικρή, η ποσότητα του cDNA που λαμβάνεται είναι επίσης σχετικά μικρή, σε αντίθεση με την PCR, η οποία έχει αποτέλεσμα ενίσχυσης, επομένως είναι βασικά αδύνατο να ανιχνευθεί.

αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης cDNA
Δεύτερον, ιδανικά, η αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιείται ένα προς ένα, αλλά καμία αντίστροφη μεταγραφάση από καμία εταιρεία δεν μπορεί να επιτύχει αυτό το αποτέλεσμα.Βασικά, η αποτελεσματικότητα των περισσότερων αντίστροφων μεταγραφασών κυμαίνεται μεταξύ 30-50%.Αν συμβαίνει αυτό, θα προτιμούσαμε να έχουμε μια σχετικά σταθερή απόδοση αντίστροφης μεταγραφής, που είναι αυτό που θέλουμε να δούμε στο σχήμα: 3 RNA παίρνουν 2 cDNA, 6 RNA παίρνουν 4 cDNA, οπότε ανεξάρτητα από το πόσο δείγμα είναι φορτωμένο, η απόδοση της αντίστροφης μεταγραφής είναι σχετικά σταθερή.Δεν θέλουμε να δούμε την κατάσταση όπου η αποτελεσματικότητα της αντίστροφης μεταγραφής είναι ασταθής και η υψηλή συγκέντρωση αναστέλλεται.

Λοιπόν, πώς να επαληθεύσετε εάν η απόδοση της αντίστροφης μεταγραφής είναι σταθερή;Η μέθοδος είναι πολύ απλή, χρειάζεται μόνο να κάνετε μια δοκιμή σύγκρισης: η μία είναι να αντιστρέψετε τη μεταγραφή σε cDNA μετά τον διπλασιασμό της αραίωσης του RNA και η άλλη είναι να κάνετε διπλασιασμό μετά την αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA και μετά να κάνετε qPCR για να δείτε την κλίση που προκύπτει.Ως κορυφαίος μαθητής, θα πρέπει να το καταλάβεις σε δευτερόλεπτα.Οπως φαίνεται παρακάτω:

Αραίωση RNA και cDNA για να ελεγχθεί εάν η αποτελεσματικότητα της αντίστροφης μεταγραφής είναι σταθερή
Αντίστροφη μεταγραφάση και κιτ
Πώς μπορεί η τέλεια φθορίζουσα ποσοτική PCR να έχει εξαιρετική αντίστροφη μεταγραφάση και κιτ.Η ανάστροφη μεταγραφάση χωρίζεται χονδρικά σε δύο τύπους ανάλογα με την πηγή, AMV ήM-MLV, και η απόδοσή τους είναι ίδια με αυτή που φαίνεται στον πίνακα.

Δραστηριότητα RNase H
Η RNase H είναι ριβονουκλεάση Η, η κινεζική ονομασία είναι ριβονουκλεάση Η, η οποία είναι μια ενδοριβονουκλεάση που μπορεί να υδρολύσει ειδικά το RNA στην υβριδική αλυσίδα DNA-RNA.Η RNase H δεν μπορεί να υδρολύσει τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς σε μονόκλωνο ή δίκλωνο DNA ή RNA, δηλαδή δεν μπορεί να χωνέψει μονόκλωνο ή δίκλωνο DNA ή RNA.Χρησιμοποιείται συνήθως στη σύνθεση του δεύτερου κλώνου του cDNA.

Είναι περίεργο πράγμα.Λέμε ότι η ανάστροφη μεταγραφάση έχει δράση RNase H, όχι ότι η αντίστροφη μεταγραφάση περιέχει RNase H και μπορεί να μην είναι δυνατός ο διαχωρισμός της RNase H από την ανάστροφη μεταγραφάση, ίσως λόγω της διαμόρφωσης ορισμένων ομάδων στην ανάστροφη μεταγραφάση Αυτή η δραστηριότητα προκαλείται από την ανάστροφη μεταγραφάση.

Επομένως, ανεξάρτητα από την υψηλότερη αποτελεσματικότητα αντίστροφης μεταγραφής του AMV, η δράση του RNase H μειώνει την απόδοση του cDNA.Φυσικά, οι κατασκευαστές αντιδραστηρίων βελτιστοποιούν συνεχώς τα προϊόντα τους για να εξαλείψουν τη δραστηριότητα της RNase H στην ανάστροφη μεταγραφάση όσο το δυνατόν περισσότερο για να αυξήσουν την απόδοση του cDNA.
Θερμοκρασία ανόπτησης

Δευτερογενής δομή του RNA σε διαφορετικές θερμοκρασίες
Δείτε το παραπάνω σχήμα για τη δευτερογενή δομή του RNA σε διαφορετικές θερμοκρασίες και χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό εργαλείο mFold για να προσδιορίσετε τη δευτερεύουσα δομή του θραύσματος στόχου υπό συγκεκριμένες συνθήκες θερμοκρασίας και συγκέντρωσης άλατος.Στους 55°C, η δευτερογενής δομή του RNA είναι ακόμα πολύ περίπλοκη, η αντίστροφη μεταγραφάση δεν μπορεί να λειτουργήσει και η δευτερεύουσα δομή δεν μπορεί να επιλυθεί πλήρως μέχρι τους 65°C, ενώ η βέλτιστη θερμοκρασία των AMV και M-MLV είναι πολύ χαμηλότερη από αυτή τη θερμοκρασία.
τι να κάνω?Η δευτερεύουσα δομή είναι το συμπληρωματικό ζευγάρωμα του ίδιου του προτύπου, το οποίο οδηγεί σε ισχυρό ανταγωνισμό μεταξύ του εκκινητή και της ανάστροφης μεταγραφάσης και του εκμαγείου, με αποτέλεσμα μια σειρά προβλημάτων όπως χαμηλό Ε και κακή επαναληψιμότητα.

τι να κάνω?Αυξήστε μόνο τη θερμοκρασία ανόπτησης όσο το δυνατόν περισσότερο.

Πολλοί κατασκευαστές αντιδραστηρίων βελτιώνουν την αντίστροφη μεταγραφάση τους μέσω της γενετικής μηχανικής.Μερικοί αυξάνουν τη θερμοκρασία της αντίδρασης, όπως οι Jifan και Aidelai, και άλλοι αφαιρούν τη δραστική ομάδα του ενζύμου RNase H για να βελτιώσουν τη συγγένεια μεταξύ του ενζύμου και του εκμαγείου RNA.Η υψηλή συγγένεια μπορεί να συμπιέσει ανταγωνιστικά τη δευτερεύουσα δομή και να διαβάσει ομαλά, και επίσης να βελτιώσει σημαντικά την αποτελεσματικότητα της αντίστροφης μεταγραφής.
Σημείο κλειδί: Η αντίστροφη μεταγραφή είναι πιο σημαντική για την επιδίωξη της συνέπειας της αποτελεσματικότητας της αντίστροφης μεταγραφής (τα ένζυμα δεν πρέπει να είναι μόνο αποτελεσματικά αλλά και σταθερά), αντί για την ποσότητα του δείγματος που έχει φορτωθεί, αν δεν είναι ιδιαίτερα μεγάλης κλίμακας φθορίζουσα ποσοτική PCR, δεν θα είναι καθόλου δυνατή.Πολλαπλά cDNA.
Διάφοροι κατασκευαστές έχουν κάνει επίσης κάποιες προσπάθειες για την επιδίωξη της συνέπειας.Για παράδειγμα, οι περισσότερες εταιρείες έχουν πλέον συσκευάσει την αντίστροφη μεταγραφή ως τυπικό κιτ προς πώληση, κάτι που είναι μια καλή επιλογή.
Για παράδειγμα, τα κιτ της σειράς RT Easy της Foregene:

RT Easy I (Κύριο προμίγμα για κιτ σύνθεσης cDNA πρώτου κλώνου)

MIQE (5) – πληροφορίες γονιδίου στόχου

Το παραπάνω σχήμα εξηγεί
1. Το εάν αυτό το γονίδιο είναι αποτελεσματικό για επαναλαμβανόμενα πειράματα μπορεί γενικά να επαληθευτεί με επαναλαμβανόμενα πειράματα.
2. Γονιδιακή ταυτότητα, ξέρετε.
3. Το μήκος του γονιδίου, το συνολικό μήκος του γονιδίου στόχου δεν είναι σίγουρα κανένα πρόβλημα.Όταν σχεδιάζετε εκκινητές, βεβαιωθείτε ότι το μήκος του αμπλικονίου είναι μεταξύ 80-200 bp για να εξασφαλίσετε καλύτερη απόδοση ενίσχυσης.
4. Πληροφορίες σύγκρισης Sequence Blast, το γονίδιο στόχος πρέπει να συγκριθεί στην τράπεζα γονιδίων για να αποφευχθεί η μη ειδική ενίσχυση.
5. Παρουσία ψευδογονιδίων.Ένα ψευδογονίδιο είναι μια αλληλουχία DNA παρόμοια με ένα φυσιολογικό γονίδιο αλλά χάνει την κανονική του λειτουργία.Συχνά υπάρχει στην πολυγονιδιακή οικογένεια των ευκαρυωτών.Συνήθως αντιπροσωπεύεται από ψ.Είναι ένα μη λειτουργικό αντίγραφο γονιδιωματικού DNA στο γονιδίωμα που μοιάζει πολύ με την κωδικοποιητική αλληλουχία γονιδίου., γενικά δεν μεταγράφονται και δεν έχουν σαφή φυσιολογική σημασία.
6. Θέση εκκινητών σε σχέση με εξόνια και ιντρόνια.Τα πρώτα χρόνια, όταν λύναμε το πρόβλημα της μόλυνσης του DNA, δίναμε συχνά προσοχή στις θέσεις των εκκινητών, των εξονίων και των ιντρονίων και γενικά σκεφτήκαμε να σχεδιάσουμε εκκινητές κατά μήκος των ιντρονίων για να αποφύγουμε την ενίσχυση του DNA.Δείτε το παρακάτω σχήμα: το μαύρο αντιπροσωπεύει εσώνια, τα διάφορα μπλε αντιπροσωπεύουν εξόνια, το ροζ αντιπροσωπεύει τους κοινούς εκκινητές και το έντονο κόκκινο αντιπροσωπεύει τους εκκινητές που εκτείνονται σε εσώνια.

Σχηματικό, ποτέ αληθινό
Τι τέλειο σχέδιο φαίνεται αυτό, αλλά στην πραγματικότητα, στις περισσότερες περιπτώσεις, οι εκκινητές τρανς-ιντρονίων δεν είναι τόσο μαγικοί όσο φανταζόμαστε και θα προκαλέσουν επίσης μη ειδική ενίσχυση.Έτσι, ο καλύτερος τρόπος για να αποφευχθεί η μόλυνση του DNA είναι η πλήρης αφαίρεση του DNA.
7. Πρόβλεψη διαμόρφωσης.Χρησιμοποιώντας ξανά αυτό το παράδειγμα, χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό εργαλείο mFold για να προσδιορίσετε τη δευτερεύουσα δομή του θραύσματος στόχου σε μια συγκεκριμένη θερμοκρασία και συγκέντρωση άλατος.

Δευτερογενής δομή του RNA σε διαφορετικές θερμοκρασίες
Η δευτερεύουσα δομή είναι το συμπληρωματικό ζευγάρωμα του ίδιου του προτύπου, το οποίο θα οδηγήσει σε ισχυρό ανταγωνισμό μεταξύ του ζευγαρώματος εκκινητή και προτύπου, και οι πιθανότητες σύνδεσης του εκκινητή είναι μικρότερες, με αποτέλεσμα μια σειρά προβλημάτων όπως χαμηλό E και κακή επαναληψιμότητα.Μέσω της πρόβλεψης λογισμικού, εάν δεν υπάρχει πρόβλημα δευτερεύουσας δομής, αυτό θα ήταν υπέροχο.Εάν υπάρχει, το επόμενο άρθρο μας θα συζητήσει συγκεκριμένα πώς να λύσετε αυτό το πρόβλημα.

MIQE (6)-qPCR Ολιγονουκλεοτίδια

Για τη φθορίζουσα ποσοτική PCR, το πρώτο πράγμα με το οποίο παλεύετε καθημερινά είναι η εξαγωγή RNA και το δεύτερο πράγμα μπορεί να είναι ο σχεδιασμός εκκινητών.
Πρώτα απ 'όλα, εξακολουθούμε να ελέγχουμε τους κανόνες σχετικά με το σχεδιασμό ασταριού σύμφωνα με τη λίστα ελέγχου MIQE.Είναι τόσο απλό που μπορούν να γελάσουν οι ακάθαρτοι, και μπορούμε να το τελειώσουμε με μια φράση: μάθετε τη σειρά και τη θέση του αισθητήρα ασταριού και τη μέθοδο τροποποίησης.Για τη μέθοδο καθαρισμού εκκινητών, η σύνθεση εκκινητών είναι τόσο φθηνή επί του παρόντος, η qPCR αξίζει τις μεθόδους καθαρισμού PAGE και παραπάνω και οι πληροφορίες του οργάνου σύνθεσης δεν είναι σημαντικές.Πολλοί άνθρωποι κάνουν primer εδώ και δεκαετίες και δεν γνωρίζουν ότι το synthesizer είναι το ABI3900.
Όσον αφορά τις αρχές της σχεδίασης ασταριού, δεν χρειάζεται να τις απομνημονεύετε περιληπτικά, επειδή τα περισσότερα λογισμικά σχεδίασης ασταριών ή ηλεκτρονικά εργαλεία μπορούν να επιλύσουν αυτά τα προβλήματα (συνιστώμενο διαδικτυακό εργαλείο primer3.ut.ee/) και το 99,999% του σχεδιασμού ασταριού δεν γίνεται με το χέρι.
Απλώς ελέγξτε τα ακόλουθα σημεία μετά το σχεδιασμό των ασταριών:
1. Σχεδιασμός εκκινητών κοντά στο άκρο 3': Στην περίπτωση χρήσης εκκινητών ολίγο dT για σύνθεση πρώτου κλώνου cDNA, λαμβάνοντας υπόψη την αποτελεσματικότητα της αντίστροφης μεταγραφής και την ακεραιότητα του RNA, οι σχεδιασμένοι εκκινητές πρέπει να σχεδιάζονται κοντά στο άκρο 3' για να βελτιωθεί η απόδοση ενίσχυσης.Χρησιμοποιήστε μια εικόνα για να εξηγήσετε ως εξής (δεν υπάρχει τρόπος να το καταλάβετε αυτό):

Γιατί πρέπει να σχεδιάζονται αστάρια κοντά στο άκρο 3′, δεν πρέπει να είναι αλήθεια
2. Τιμή TM: Η τιμή Tm είναι στους 55-65°C (επειδή η δραστηριότητα εξωνουκλεάσης είναι η υψηλότερη στους 60°C) και η περιεκτικότητα σε GC είναι στο 40%-60%.
3. BLAST: Προκειμένου να αποφευχθεί η μη ειδική ενίσχυση του γονιδιώματος, το Blast πρέπει να χρησιμοποιείται για συμπληρωματική επαλήθευση.

Διαδικασία MIQE(7)—qPCR

1. κιτ qPCR
Σύμφωνα με τις απαιτήσεις του MIQE, πρέπει να περιγράψουμε με σαφήνεια τις πλήρεις συνθήκες αντίδρασης στο άρθρο, συμπεριλαμβανομένης της διαμόρφωσης του συστήματος αντίδρασης PCR, του κιτ που χρησιμοποιείται, ποιος είναι ο κατασκευαστής, πόσο μεγάλο είναι το σύστημα αντίδρασης, εάν χρησιμοποιείται η μέθοδος βαφής ή η μέθοδος ανίχνευσης, οι ρυθμίσεις του προγράμματος PCR.Οι βετεράνοι οδηγοί σίγουρα θα διαπιστώσουν ότι εφόσον επιλεγεί το κιτ, οι παραπάνω πληροφορίες είναι βασικά καθορισμένες.
Επί του παρόντος, η κατασκευή και η παραγωγή κιτ φθορισμού ποσοτικής PCR είναι μια πολύ ώριμη τεχνολογία.Εφόσον δεν επιλέγετε εξαιρετικά κακούς κατασκευαστές, η πιθανότητα προβλημάτων δεν είναι υψηλή, αλλά θέλουμε να μοιραστούμε μαζί σας μερικά σημεία:
Ένζυμο Hot-start Taq:Το πιο σημαντικό μέρος της PCR είναι το ένζυμο Hot-start Taq.Τα ένζυμα θερμής εκκίνησης στην αγορά χωρίζονται γενικά σε δύο τύπους, ο ένας είναι ένα χημικά τροποποιημένο ένζυμο θερμής εκκίνησης (μπορείτε να το φανταστείτε ως ενσωμάτωση παραφίνης) και ο άλλος είναι ένα ένζυμο θερμής εκκίνησης για τροποποίηση αντισωμάτων (δέσμευση αντιγόνου-αντισώματος).Η χημική τροποποίηση είναι ένας πρώιμος τρόπος ενζύμων θερμής εκκίνησης.Όταν επιτευχθεί μια ορισμένη θερμοκρασία, το ένζυμο θα απελευθερώσει τη δραστηριότητά του.Το ένζυμο θερμής εκκίνησης τροποποιημένο με αντίσωμα χρησιμοποιεί βιολογικές μεθόδους για να εμποδίσει τη δραστηριότητα του ενζύμου.Όταν επιτευχθεί μια ορισμένη θερμοκρασία, το αντίσωμα θα μετουσιωθεί και θα απενεργοποιηθεί ως πρωτεΐνη και η ενζυμική δραστηριότητα θα τεθεί στο παιχνίδι.

Ωστόσο, σε τι χρησιμεύει αυτό;Αυτή είναι η περίπτωση, η δραστικότητα απελευθέρωσης των τροποποιημένων με αντισώματα ενζύμων είναι ταχύτερη από εκείνη των χημικά τροποποιημένων ενζύμων, επομένως όσον αφορά την ευαισθησία, τα ένζυμα τροποποιημένα με αντίσωμα έχουν ένα μικρό πλεονέκτημα, έτσι ώστε βασικά να μην υπάρχουν χημικά τροποποιημένα ένζυμα στα κιτ στην αγορά.Εάν υπάρχει, τότε η τεχνολογία αυτού του κατασκευαστή είναι ακόμα κολλημένη στην εποχή της χιλιετίας.
Συγκέντρωση ιόντων μαγνησίου:Η συγκέντρωση ιόντων μαγνησίου είναι πολύ σημαντική στην αντίδραση PCR.Η κατάλληλη συγκέντρωση ιόντων μαγνησίου μπορεί να προάγει την απελευθέρωση της δραστηριότητας του ενζύμου Taq.Εάν η συγκέντρωση είναι πολύ χαμηλή, η ενζυμική δραστηριότητα θα μειωθεί σημαντικά.Εάν η συγκέντρωση είναι πολύ υψηλή, η καταλυόμενη από ένζυμο μη ειδική ενίσχυση θα ενισχυθεί.Η συγκέντρωση των ιόντων μαγνησίου θα επηρεάσει επίσης την ανόπτηση των εκκινητών, τη θερμοκρασία τήξης του εκμαγείου και τα προϊόντα PCR, επηρεάζοντας έτσι την απόδοση των ενισχυμένων θραυσμάτων.Η συγκέντρωση των ιόντων μαγνησίου γενικά ελέγχεται στα 25 mM.Φυσικά, για ένα καλό κιτ, η συγκέντρωση των ιόντων μαγνησίου πρέπει να ελέγχεται καλά.Μερικοί έμποροι προσθέτουν ένα χηλικό παράγοντα ιόντων μαγνησίου στο αντιδραστήριο, το οποίο μπορεί να επιτύχει το αποτέλεσμα της αυτόματης ρύθμισης της συγκέντρωσης ιόντων μαγνησίου.
Συγκέντρωση φθορίζουσας βαφής:Η φθορίζουσα βαφή, η οποία είναι το πράσινο SYBR που χρησιμοποιούμε συνήθως, δημιουργεί κυρίως φθορισμό με τη δέσμευση στο δευτερεύον αυλάκι του διπλού κλώνου DNA, επειδή η δέσμευση των χρωστικών σε διπλό έλλειμμα DNA είναι μη ειδικό, δηλαδή, που λέει ότι το διπλό στρώμα DNA συνδυάζεται με αυτό, ο φθορίζοντας μπορεί να συμβεί με το φόντο του συστήματος.
ΥΓ: Λόγω των φωτοευαίσθητων ιδιοτήτων του, τα προϊόντα στην αγορά συσκευάζονται γενικά σε καφέ αδιαφανείς σωλήνες φυγοκέντρησης (όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα).Ωστόσο, αυτό θα αντιμετωπίσει ένα πρόβλημα.Είναι δύσκολο να δούμε αν το υγρό αναρροφάται κατά τη δειγματοληψία.Από αυτή την άποψη, το Qingke είναι πράγματι το πιο φιλικό προς το χρήστη (όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα) και ο διαφανής σωλήνας είναι συσκευασμένος σε μια αδιαφανή τσίγκινο σακούλα.Στη συνέχεια, τοποθετήστε το σε μια τσίγκινα σακούλα, λαμβάνοντας υπόψη την ευκολία της αποφυγής του φωτός και της δειγματοληψίας.Πρέπει να επιλέξετε τον σωστό αριθμό προϊόντος.Το TSE204 είναι μια εξαιρετικά οικονομική ύπαρξη, που με κάνει να θέλω να φυτέψω γρασίδι.

Η συγκέντρωση της φθορίζουσας βαφής είναι επίσης πολύ σημαντική.Εάν η συγκέντρωση είναι πολύ χαμηλή, η καμπύλη ενίσχυσης δεν θα ανέβει στο μεταγενέστερο στάδιο και δεν είναι τέλεια.εάν η συγκέντρωση είναι πολύ υψηλή, θα προκαλέσει παρεμβολές θορύβου.Δεδομένου ότι η φθορίζουσα ποσοτική PCR εξαρτάται κυρίως από την τιμή CT, εάν η συγκέντρωση της φθορίζουσας βαφής δεν ρυθμιστεί σωστά, το χαμηλό σημείο είναι καλύτερο από το υψηλό.Φυσικά, η κατάλληλη συγκέντρωση βαφής είναι η καλύτερη.

ROX: Οι βαφές ROX χρησιμοποιούνται για τη διόρθωση σφαλμάτων σήματος φθορισμού από καλά-καλά.Ορισμένοι κατασκευαστές οργάνων απαιτούν βαθμονόμηση, ενώ άλλοι όχι.Για παράδειγμα, η χρήση του οργάνου ενίσχυσης PCR πραγματικού χρόνου της Thermo Fisher Scientific συνήθως απαιτεί βαθμονόμηση, συμπεριλαμβανομένων των 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, κ.λπ. Οι γενικές οδηγίες του κιτ θα το περιγράφουν.
Το qPCR Mix της Foregene περιέχει επίσης βαφή ROX, η οποία είναι βολική για χρήση σε διάφορα μοντέλα.

Real Time PCR Kit-Taqman

Θεραπεία αδύναμου δεσμού υδρογόνου: Η επεξεργασία των ασθενών δεσμών υδρογόνου είναι ένα σχετικά τεχνικό θέμα.Τίποτα δεν έχει διαβάσει τα εγχειρίδια πολλών κιτ, αλλά κανένα από αυτά δεν ανέφερε αυτό το θέμα.Στην πραγματικότητα, είναι τόσο σημαντικό.Ο συνδυασμός των βάσεων εξαρτάται κυρίως από την αντοχή των δεσμών υδρογόνου.Οι ισχυροί δεσμοί υδρογόνου είναι κανονική ενίσχυση και οι ασθενείς δεσμοί υδρογόνου οδηγούν σε μη ειδική ενίσχυση.Εάν οι ασθενείς δεσμοί υδρογόνου δεν μπορούν να εξαλειφθούν καλά, δεν μπορεί να αποφευχθεί η μη ειδική ενίσχυση.Στο πλαίσιο του συγγραφέα, μόνο λίγες εταιρείες έχουν παρατηρήσει αυτό το πρόβλημα.Όταν αγοράζετε το κιτ, μπορείτε να ανατρέξετε στο εάν έχετε σκεφτεί μια λύση από αυτή την άποψη για το κιτ που θέλετε να επιλέξετε.

Όγκος αντίδρασης: Το σύστημα 20-50ul χρησιμοποιείται πιο συχνά και οι μικρότεροι όγκοι είναι πιθανό να προκαλέσουν σφάλματα.Σε γενικές γραμμές, οι οδηγίες του κιτ θα συνιστούν τη χρήση όγκων αντίδρασης PCR.Μην είστε έξυπνοι και χρησιμοποιήστε μικρότερους όγκους για να εξοικονομήσετε κόστος.ο στόχος του.Ο όγκος που προτείνουν οι έμποροι έχει πράγματι δοκιμαστεί και μπορεί να μην μπορούν να λύσουν το πρόβλημα των σφαλμάτων που προκαλούνται από μικρούς όγκους.
2. Ο κατασκευαστής και ο αριθμός αντικειμένου της πλάκας σωλήνα
Όλοι γνωρίζουν την αρχή της φθορίζουσας ποσοτικής PCR.Η συλλογή φθορισμού πραγματοποιείται κυρίως μέσω καλυμμάτων σωλήνων PCR.Όταν επιλέγετε αναλώσιμα PCR, δώστε προσοχή σε δύο σημεία: καλή μετάδοση φωτός και κατάλληλη για το όργανο.Σε γενικές γραμμές, οι σανίδες και οι σωλήνες των mainstream επωνυμιών είναι μια χαρά, αλλά πρέπει να επιλέξετε προσεκτικά όσον αφορά την προσαρμογή, διαφορετικά δεν θα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε το όργανο.

4. Γνώση ανώτατου επιπέδου

Επικύρωση MIQE (8)—qPCR
Αυτή είναι η κορυφαία προτεραιότητα του qPCR!Τόσοι ήρωες έχουν πέσει στην άμμο εδώ.Φυσικά, είναι επίσης πιθανό να είστε τυχεροί και τα γονίδια που μελετήσατε να είναι απλά, οπότε επιπλέατε μέσα από τη σπηλιά πάγου κατά μήκος του ανέμου.Οι πληροφορίες επαλήθευσης του qPCR προορίζονται να ελέγξουν την αξιοπιστία των δεδομένων.Παραθέτουμε τις απαραίτητες πληροφορίες επαλήθευσης ως εξής:

1.Δοκιμή ειδικότητας
Η ειδικότητα της ενίσχυσης του γονιδίου στόχου ελέγχεται ελέγχοντας εάν η εικόνα της ηλεκτροφόρησης είναι μία μονή ζώνη.επαλήθευση αλληλουχίας·καμπύλη τήξης για να δούμε αν ο χάρτης κορυφής είναι ενιαίος.επαλήθευση ενζυμικής πέψης και άλλες μέθοδοι.
Εδώ, εστιάζουμε στο tη ανάλυση της μη ειδικής ενίσχυσης με τη μέθοδο των καμπυλών τήξης.Σε γενικές γραμμές, όταν σχεδιάζουμε εκκινητές, το μέγεθος του τεμαχίου προϊόντος απαιτείται να είναι στην περιοχή 80-200 bp, γεγονός που καθιστά τη θερμοκρασία τήξης του προϊόντος PCR 80-85 °C.Επομένως, εάν υπάρχουν διάφορες κορυφές, πρέπει να υπάρχουν άλλα μη ειδικά προϊόντα ενίσχυσης.Εάν η κορυφή εμφανίζεται κάτω από τους 80°C, θεωρείται γενικά ότι είναι διμερές εκκινητή.εάν η κορυφή εμφανίζεται πάνω από 85°C, γενικά θεωρείται ότι είναι μόλυνση από DNA ή περισσότερο μη ειδική ενίσχυση μεγάλων θραυσμάτων.
Σημείωση: Μερικές φορές υπάρχει μόνο μία κορυφή στους 80°C.Αυτή τη στιγμή, αυτή η έννοια πρέπει να τηρηθεί.Είναι πιθανό ότι τα αποτελέσματα της ενίσχυσης είναι όλα διμερή εκκινητών.

Κανονική καμπύλη τήξης (μονή κορυφή χωρίς μη ειδική ενίσχυση)

Προβληματική καμπύλη τήξης (μη ειδική ενίσχυση ψευδών κορυφών)
【Ανάλυση περίπτωσης】

Υπάρχει μια κύρια κορυφή, αλλά το διμερές αστάρι είναι σοβαρό
Η καμπύλη τήξης μιας κορυφής στο παρακάτω σχήμα μπορεί εύκολα να ξεγελάσει τα μάτια σας, νομίζοντας ότι είναι ένα τέλειο πείραμα, αλλά το αποτέλεσμα είναι εντελώς λάθος.Αυτή τη στιγμή, πρέπει να δούμε τη θερμοκρασία τήξης.Η μέγιστη θερμοκρασία είναι κάτω από 80°C, η οποία είναι εντελώς αστάρι-διμερές.

Κανένα θραύσμα στόχου, όλα τα διμερή εκκινητών
Εδώ, ο αδερφός μου δεν μπορεί να σταματήσει.Η παρακάτω εικόνα είναι μια φωτογραφία που τραβήχτηκε με ένα κινητό τηλέφωνο που μου έστειλε ένας σαθρός.Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποίησε είναι όλα κοινά χρησιμοποιούμενα εμπορικά σήματα στη βιομηχανία.Άλλαξε από μια επωνυμία προθέματος T σε άλλη επωνυμία προθέματος Τ.Νομίζω ότι το έχετε ήδη μαντέψει.Ο σκέτος μου φώναξε: «Το αντιδραστήριο που χρησιμοποιήθηκε στην πρώτη εικόνα είναι πολύ καλό και η κορυφή είναι μονήρη.Αργότερα, μετά τη χρήση του αντιδραστηρίου που προτείνατε, γίνεται σαν τη δεύτερη εικόνα, με μικτές κορυφές.Με έχεις κάνει μίζερο."
Διαχωρίστε τα δύο γραφήματα.Με την πρώτη ματιά, το ένα έχει μια μονή κορυφή και το άλλο έχει διπλή κορυφή.Ανοησίες, μια και μόνο κορυφή είναι φυσικά μια χαρά.Είναι αλήθεια ότι?
Χειρότερα από το Dou E, αν βάλω τις δύο εικόνες στην παρακάτω εικόνα, θα καταλάβετε αμέσως.Στην πραγματικότητα, παραλύουμε εύκολα από αυτού του είδους την εικόνα.Μετά από προσεκτική ανάλυση, βρήκαμε ότι: η κορυφή του πρώτου σχήματος είναι στους 75°C, που είναι πλήρως διμερές αστάρι.η κορυφή του δεύτερου σχήματος εμφανίζεται στους 75°C και στους 82°C, τουλάχιστον υπάρχουν Το προϊόν εμφανίζεται.

Εικόνες με σχόλια από μαθητές
Έτσι, το θεμελιώδες πρόβλημα δεν είναι το πρόβλημα των αντιδραστηρίων, αλλά το πρόβλημα του σχεδιασμού του εκκινητή.Ταυτόχρονα, αποδεικνύει επίσης ότι ορισμένες μεγάλες μάρκες δεν είναι ποιότητας σιδήρου, και αποδεικνύει επίσης αυτό που είπε ο αδερφός μου πριν: Δεν είναι η μάρκα αντιδραστηρίου που υποστηρίζει το άρθρο σας.Είναι το άρθρο σας που υποστήριξε τη μάρκα των αντιδραστηρίων.Απλά φανταστείτε, εάν ο σαθρός δεν άλλαζε τα αντιδραστήρια, θα έστελναν λάθος δεδομένα στο περιοδικό και αυτό που θα συνέβαινε θα ήταν τραγωδία.
2. Τιμή Ct του τυφλού ελέγχου
Μην εξηγείς, αν το κενό κοντρόλ έχει τιμή Ct, δεν είναι ρύπανση;Ωστόσο, πρέπει να καταλάβετε ποιο κενό στοιχείο ελέγχου έχει τιμή Ct.Εάν είναι NTC, σημαίνει ότι υπάρχει ξένο DNA, όπως μόλυνση από αντιδραστήρια.Εάν είναι NRT, σημαίνει ότι το εξαγόμενο RNA έχει μόλυνση από DNA.
3. Τυπική καμπύλη
Συμπεριλαμβανομένου του τύπου κλίσης και υπολογισμού, η αποτελεσματικότητα της PCR μπορεί να υπολογιστεί μέσω του τύπου.Ένα τέλειο πείραμα απαιτεί η κλίση της τυπικής καμπύλης να πλησιάζει το 3,32 και το R² να προσεγγίζει το 0,9999.
4. Γραμμική δυναμική περιοχή
Το δυναμικό εύρος της αντίδρασης είναι γραμμικό.Σύμφωνα με το πρότυπο που χρησιμοποιείται για τη δημιουργία της τυπικής καμπύλης, το δυναμικό εύρος θα πρέπει να περιλαμβάνει τουλάχιστον 5 βαθμίδες συγκέντρωσης και να δίνει προσοχή στην αλλαγή των τιμών Ct σε υψηλές και χαμηλές διαβαθμίσεις συγκέντρωσης.
5. Ακρίβεια ανίχνευσης
Οι αλλαγές στα αποτελέσματα του qPCR, δηλαδή η κακή επαναληψιμότητα, δηλαδή η κακή ακρίβεια, προκαλούνται από πολλούς παράγοντες, όπως η θερμοκρασία, η συγκέντρωση και η λειτουργία.Η ακρίβεια qPCR γίνεται γενικά λιγότερο ελεγχόμενη καθώς μειώνεται ο αριθμός αντιγράφων.Ιδανικά εντός της πειραματικής παραλλαγής, αυτή η τεχνική παραλλαγή θα πρέπει να διαφέρει από τη βιολογική παραλλαγή και τα βιολογικά αντίγραφα μπορούν να αντιμετωπίσουν άμεσα τις στατιστικές διαφορές στα αποτελέσματα qPCR μεταξύ ομάδων ή θεραπειών.Ειδικότερα για τις διαγνωστικές αναλύσεις, πρέπει να αναφέρεται η καλύτερη ακρίβεια μεταξύ των δοκιμών (επαναληψιμότητα) μεταξύ των τοποθεσιών και των χειριστών.
6. Αποδοτικότητα ανίχνευσης και LOD (σε multiplex qPCR)
Το LOD είναι η χαμηλότερη συγκέντρωση του 95% των θετικών δειγμάτων που ανιχνεύθηκαν.Με άλλα λόγια, η συγκέντρωση του LOD που περιέχεται σε ένα σύνολο αντιγράφων γονιδίου στόχου δεν πρέπει να υπερβαίνει το 5% των αποτυχημένων αντιδράσεων.Όταν εκτελείτε ανάλυση multiplex qPCR, ειδικά για ταυτόχρονη ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων ή πολυμορφισμών, το multiplex qPCR πρέπει να παρέχει στοιχεία ότι η ακρίβεια πολλαπλών θραυσμάτων στόχου δεν διακυβεύεται στον ίδιο σωλήνα, πολλαπλή ανίχνευση και ανίχνευση μεμονωμένου σωλήνα Η αποτελεσματικότητα και το LOD θα πρέπει να είναι τα ίδια.Ειδικά όταν τα γονίδια-στόχοι υψηλής συγκέντρωσης και τα γονίδια-στόχοι χαμηλής συγκέντρωσης ενισχύονται ταυτόχρονα, αυτό το πρόβλημα πρέπει να δοθεί προσοχή.
Προβλήματα και λύσειςΣε γενικές γραμμές, τα προβλήματα που αντιμετωπίζονται συχνά στον εντοπισμό σφαλμάτων qPCR επικεντρώνονται στις ακόλουθες πτυχές:
·μη ειδική ενίσχυση
·Δύσκολη επιλογή συγκέντρωσης ασταριού και πρόβλημα με αστάρι-διμερή
·Η θερμοκρασία ανόπτησης είναι ανακριβής
·Η δευτερεύουσα δομή επηρεάζει την απόδοση ενίσχυσης
μη ειδική ενίσχυση
μη ειδική ενίσχυσησυμβαίνει , γενικά θεωρείται αν ο σχεδιασμός του ασταριού δεν είναι κατάλληλος, αλλά εάν δεν βιάζεστε να αλλάξετε τα αστάρια, μπορείτε να δοκιμάσετε πρώτα τις ακόλουθες μεθόδους (η αρχή επισυνάπτεται επίσης):
·Αυξήστε τη θερμοκρασία ανόπτησης – προσπαθήστε να δημιουργήσετε ασθενείς δεσμούς υδρογόνου που δεν μπορούν να διατηρηθούν.
· Συντόμευση του χρόνου ανόπτησης και επιμήκυνσης – μείωση της πιθανότητας αδύναμων δεσμών υδρογόνου.
·Μειώστε τη συγκέντρωση εκκινητών – μειώστε την πιθανότητα δέσμευσης περιττών εκκινητών και περιοχών μη-στόχων.
Χαμηλή απόδοση ενίσχυσης
Η αντίθετη κατάσταση από τη μη ειδική ενίσχυση - χαμηλή απόδοση ενίσχυσης και τα μέτρα για την αντιμετώπιση της χαμηλής απόδοσης ενίσχυσης είναι ακριβώς το αντίθετο:
· Παρατείνετε το χρόνο ανόπτησης και επιμήκυνσης.
·Αλλαγή σε PCR τριών σταδίων και μείωση της θερμοκρασίας ανόπτησης.
·Αυξήστε τη συγκέντρωση του αστάρι.
Ps: Πολλοί μεταπτυχιακοί φοιτητές που γεννήθηκαν τη δεκαετία του '90 δεν θέλουν να μελετήσουν πώς να διορθώνουν πειράματα και ελπίζουν ότι το κιτ μπορεί να λύσει πλήρως το πρόβλημα (αν θέλετε να πάτε σε μια εταιρεία αντιδραστηρίων για να κάνετε έρευνα και ανάπτυξη μετά την αποφοίτηση), στην πραγματικότητα, οι κατασκευαστές αντιδραστηρίων σκέφτονται επίσης έτσι, ελπίζω ότι είναι ανόητο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί όταν το αποκτήσετε, οπότε ασθενείς απορρόφησης δεσμών Η.Για να λύσουν εύκολα το πρόβλημα, οι ανόητοι πρέπει ακόμα να διαβάσουν την εισαγωγή της εταιρείας αντιδραστηρίων για να δουν αν υπάρχει παράγοντας που απορροφά ασθενείς δεσμούς υδρογόνου.
Δύσκολη επιλογή συγκέντρωσης ασταριού και πρόβλημα με αστάρι-διμερή
Μέθοδος 1: Γενικά, οι οδηγίες του κιτ για qPCR έχουν προτεινόμενα συστήματα και συνιστώμενες συγκεντρώσεις εκκινητών.
Μέθοδος 2: Εντοπισμός σφαλμάτων με ρύθμιση της κλίσης συγκέντρωσης εκκινητή.Η παρακάτω εικόνα είναι κλεμμένη από μια εταιρεία για να την απεικονίσει.Το παρακάτω σχήμα δείχνει τα ποσοτικά αποτελέσματα φθορισμού που έγιναν με τρεις βαθμίδες συγκέντρωσης εκκινητών (100 ηΜ, 250 ηΜ, 500 ηΜ) και τέσσερις βαθμίδες συγκέντρωσης εκμαγείου (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng).Η τιμή Ct των πειραματικών αποτελεσμάτων απεικονίζεται ως εξής:

Επιλογή συγκέντρωσης ασταριού Συνδυάστε κάθε συγκέντρωση ασταριού σε μια γραμμή ως εξής:

Η επιλογή της συγκέντρωσης εκκινητών είναι προφανής, η γραμμική σχέση της συγκέντρωσης εκκινητών 100 ηΜ και 250 ηΜ είναι καλύτερη και η γραμμική σχέση της συγκέντρωσης εκκινητών των 500 ηΜ είναι σχετικά κακή.Σε 100nM και 250nM, η τιμή Ct των 250nM είναι σχετικά μικρή, επομένως η βέλτιστη συγκέντρωση εκκινητή είναι 250nM.Στην καμπύλη τήξης μπορούν να φανούν γενικά σοβαρά διμερή εκκινητών.Τι γίνεται αν τα σχεδιασμένα αστάρια δεν μπορούν να αποφύγουν τα αστάρια-διμερή;
Μέθοδος 3: Μειώστε την ποσότητα των ασταριών και αυξήστε τη θερμοκρασία ανόπτησης (δεν χρειάζεται να εξηγήσετε).
Η εμπειρική τιμή της θερμοκρασίας ανόπτησης είναι 60°C.Εάν δεν είστε σίγουροι, πώς να επιλέξετε μια πιο κατάλληλη θερμοκρασία ανόπτησης;Η απάντηση είναι ίδια με την επιλογή της συγκέντρωσης ασταριού –δοκιμή κλίσης.Τραβήξτε μια φωτογραφία από την εταιρεία Bio-rad για να δείξετε το πρόβλημα.Για την ενίσχυση ενός συγκεκριμένου θραύσματος στόχου, ορίστε οκτώ διαβαθμίσεις θερμοκρασίας, η καθεμία με τρεις επαναλήψεις, και η καμπύλη ενίσχυσης που προκύπτει είναι η εξής:

επιλογή θερμοκρασίας ανόπτησης:
·70°C, 69°C—Βασικά, οι εκκινητές δεν μπορούν να συνδυαστούν, επομένως δεν υπάρχει ενίσχυση.
·67,3°C – Υπάρχει μικρή ενίσχυση στην αρχή και η τιμή Ct είναι σχετικά μεγάλη.
·64,5°C——Η τιμή Ct μειώνεται.
·Στους 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C και 55,0°C, οι τιμές Ct βασικά έτειναν να είναι σταθερές, αλλά οι τελικές τιμές φθορισμού ήταν διαφορετικές.
Πώς να επιλέξετε;Αρχή: Η πρώτη αρχή είναι η υψηλότερη τιμή Ct.Για την ίδια τιμή Ct, επιλέξτε υψηλότερη θερμοκρασία ανόπτησης για να αποφύγετε τον διμερισμό και τη μη ειδική ενίσχυση.Αν και υπάρχει υψηλότερη τιμή φθορισμού στους 55°C, μπορεί να υπάρχουν διμερή ή μη ειδική ενίσχυση σε αυτό.
Αλλά αν είστε τόσο έξυπνοι όσο εσείς, σίγουρα θα σκεφτείτε: Λογικά μιλώντας, εάν η αντίδραση PCR είναι πολύ συγκεκριμένη, εφόσον η συγκέντρωση του εκκινητή υπερβαίνει την ελάχιστη απαίτηση, τα υψηλά και τα χαμηλά σημεία δεν θα έχουν κανένα αποτέλεσμα, όπως οι φθορίζουσες βαφές και τα dNTP.Πράγματι, εφόσον η θερμοκρασία ανόπτησης έχει βελτιστοποιηθεί σωστά, η επίδραση της συγκέντρωσης του εκκινητή στην τιμή Ct θα ελαχιστοποιηθεί φυσικά.

Η θερμοκρασία ανόπτησης έχει βελτιστοποιηθεί σωστά και η επίδραση της συγκέντρωσης του εκκινητή στο CT θα ελαχιστοποιηθεί
Η δευτερεύουσα δομή επηρεάζει την απόδοση ενίσχυσης
Ας πάρουμε την εικόνα από το Bio-rad για να δείξουμε το πρόβλημα.Σχεδιάζει επίσης μια διαβάθμιση θερμοκρασίας για να ενισχύσει ένα γονίδιο με δευτερεύουσα δομή.

Αναδύεται δευτερογενής δομή
Μπορεί να φανεί ότι καθώς μειώνεται η διαβάθμιση θερμοκρασίας, αρχίζουν να εμφανίζονται προϊόντα και η τιμή Ct κινείται προς τα εμπρός, φτάνοντας στην ελάχιστη τιμή στους 60,7°C, και στη συνέχεια, καθώς η βαθμίδα θερμοκρασίας μειώνεται, η τιμή Ct γίνεται μεγαλύτερη.Αντίθετα, καθώς αυξάνεται η θερμοκρασία, η δευτερεύουσα δομή ανοίγει και η απόδοση ενίσχυσης αυξάνεται.Αφού επιτευχθεί μια συγκεκριμένη θερμοκρασία, η αύξηση της θερμοκρασίας δεν μπορεί να βελτιώσει την απόδοση ενίσχυσης.Επειδή τα αστάρια δεν μπορούν να συνδυαστούν σταθερά αυτή τη στιγμή.Επομένως,αναζητήστε τη θερμοκρασία με τη χαμηλότερη τιμή Ct, που είναι η καλύτερη θερμοκρασία για την ενίσχυση του προτύπου δευτερεύουσας δομής!Φυσικά, οι έξυπνοι ανόητοι πρέπει να γνωρίζουν ότι εάν δεν είναι απαραίτητο, είναι καλύτερο να αλλάξουν τα αστάρια και να αποφύγουν την περιοχή της δευτερεύουσας δομής.
5. Επίπεδο εφαρμογής
MIQE—Ανάλυση δεδομένων

Η ανάλυση των δεδομένων δίνεται κυρίως από το όργανο φθορίζουσας ποσοτικής PCR.Στο προηγούμενο άρθρο, έχουν γίνει πολλές εργασίες ανάλυσης δεδομένων, όπως το κενό στοιχείο ελέγχου, το οποίο έχει εξηγηθεί στο σχεδιασμό του πειράματος.Τα εσωτερικά γονίδια αναφοράς, οι επαναλαμβανόμενοι αριθμοί κ.λπ. έχουν διευκρινιστεί., εδώ εξηγούμε κυρίως την εφαρμογή της qPCR.
Η qPCR χρησιμοποιείται ευρέως και η πειραματική επαλήθευση και η διάγνωση νουκλεϊκού οξέος είναι τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα σενάρια.
απόλυτη ποσοτικοποίηση
Το log (αρχική συγκέντρωση) έχει μια γραμμική σχέση με τον αριθμό των κύκλων.Μια τυπική καμπύλη μπορεί να σχεδιαστεί από ένα πρότυπο με γνωστό αρχικό αριθμό αντιγράφου, δηλαδή, μπορεί να ληφθεί η γραμμική σχέση της αντίδρασης ενίσχυσης.Σύμφωνα με την τιμή Ct του δείγματος, μπορεί να υπολογιστεί η συγκέντρωση στο δείγμα.Ο αριθμός των προτύπων που πρέπει να συμπεριληφθούν.

Μέθοδος Απόλυτου Ποσοτικού Υπολογισμού
Η απόλυτη ποσοτικοποίηση πρέπει να βασίζεται στην τυπική καμπύλη.Για να δημιουργήσετε μια τυπική καμπύλη, απαιτείται ένα πρότυπο.Συνήθως, το πρότυπο είναι ένα πλασμίδιο που λαμβάνεται με κλωνοποίηση του γονιδίου στόχου.Γιατί είναι πλασμίδιο;Επειδή το κυκλικό πλασμιδικό DNA είναι το πιο σταθερό.Αραιώστε το πρότυπο προϊόν σε 5 έως 6 διαβαθμίσεις σύμφωνα με την αναλογία διπλασιασμού (αραίωση 10 φορές) και προσέξτε την ομοιομορφία κατά την αραίωση.Αφήστε την τιμή Ct να πέσει μεταξύ 15-30.

Τυπική προετοιμασία
Ταυτόχρονα, το προς δοκιμή δείγμα θα πρέπει επίσης να αραιωθεί ανάλογα (θυμηθείτε τον συντελεστή αραίωσης) και η τιμή Ct θα πρέπει επίσης να είναι μεταξύ 15-30.Το τυποποιημένο προϊόν + το προς δοκιμή δείγμα τοποθετούνται στο μηχάνημα μαζί.Μετά τη δοκιμή, έγινε μια τυπική καμπύλη με την πρότυπη ουσία και τα δείγματα που θα εξεταστούν εισήχθησαν στην πρότυπη καμπύλη για να υπολογιστεί η συγκέντρωση.
Η ποσοτικοποίηση του HBV του ιού της ηπατίτιδας Β είναι μια τυπική απόλυτη ποσοτικοποίηση, η οποία μπορεί να υπολογίσει τον αριθμό αντιγράφων του ιού σε 1 ml αίματος.
Υπολογισμός αριθμού αντιγράφου
Συγκέντρωση δείγματος προς δοκιμή (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × παράγοντας αραίωσης
Μοριακό βάρος δείγματος = αριθμός βάσεων × 324
Ο αριθμός αντιγράφου του προς δοκιμή δείγματος (αντίγραφα/ul) = η συγκέντρωση του προς δοκιμή δείγματος / το μοριακό βάρος του δείγματος × 6 × 1014

Μέθοδος υπολογισμού του αριθμού αντιγράφου

Τα παραπάνω είναι η μέθοδος υπολογισμού για τον προσδιορισμό της ποσότητας.Αυτό είναι ένα μαθηματικό πρόβλημα που μπορεί να λυθεί μετά την αποφοίτηση από το γυμνάσιο και τα μαθηματικά προβλήματα λύνονται γενικά από υπολογιστές.Αν δεν καταλαβαίνεις, μπορείς να έρθεις να επικοινωνήσεις.
σχετική ποσοτικοποίηση
Η σχετική ποσοτικοποίηση χρησιμοποιείται κυρίως στην επιστημονική έρευνα.Πόσοι ιοί υπάρχουν σε 1 ml αίματος, και πρόκειται για ιό DNA, αυτό είναι ένα σχετικά ντετερμινιστικό γεγονός: η ποσότητα του αίματος μπορεί να προσδιοριστεί και ο ιός DNA είναι σχετικά σταθερός.Ωστόσο, είναι δύσκολο για εμάς να συγκρίνουμε τον αριθμό των αντιγράφων μεταγραφής ενός συγκεκριμένου γονιδίου σε ένα φύλλο, επειδή είναι δύσκολο να προσδιοριστεί το μέγεθος, το βάρος και η τρυφερότητα του φύλλου, η ποσότητα του εξαγόμενου RNA είναι δύσκολο να προσδιοριστεί και η αποτελεσματικότητα της αντίστροφης μεταγραφής είναι επίσης δύσκολο να προσδιοριστεί.
Επομένως, η σχετική ποσοτικοποίηση πρέπει να εισάγει ένα στοιχείο:το εσωτερικό γονίδιο αναφοράς.
Με άλλα λόγια, η σχετική ποσοτικοποίηση είναι στην πραγματικότητα μια σύγκριση μεταξύ του γονιδίου στόχου και του εσωτερικού γονιδίου αναφοράς.Σε σύγκριση με τον ίδιο ιστό και το ίδιο κύτταρο, η επίδραση του μεγέθους του δείγματος, της ποσότητας εξαγωγής RNA, της αποτελεσματικότητας αντίστροφης μεταγραφής και της αποτελεσματικότητας της PCR είναι σχετικά μικρή.Λόγω του μικρού μεγέθους δείγματος, τόσο τα εσωτερικά γονίδια αναφοράς όσο και τα γονίδια στόχοι ήταν σχετικά μειωμένα.Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο έχουμε δώσει έμφαση στην ομοιομορφία και τη σταθερότητα στο παρελθόν.
Τα εσωτερικά γονίδια αναφοράς είναι γενικάγονίδια νοικοκυριού( house-keeping genes), τα οποία αναφέρονται σε μια κατηγορία γονιδίων που εκφράζονται σταθερά σε όλα τα κύτταρα και τα προϊόντα τους είναι απαραίτητα για τη διατήρηση των βασικών ζωτικών δραστηριοτήτων των κυττάρων.
Μην συγχέετε αυτή την έννοια.Τα γονίδια νοικοκυριό είναι όροι βιολογικής λειτουργίας, ενώ τα εσωτερικά γονίδια αναφοράς είναι πειραματικοί τεχνικοί όροι.Τα γονίδια νοικοκυριού πρέπει να περάσουν την επικύρωση για να μπορέσουν να επιλεγούν ως εσωτερικά γονίδια αναφοράς.
Για παράδειγμα, επιλέξαμε πολλά γονίδια οικιακής φροντίδας στο παρακάτω σχήμα για να δοκιμάσουμε τα επίπεδα έκφρασής τους σε διαφορετικά κύτταρα ιστών και βρήκαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης της β-2-μικροσφαιρίνης ήταν αρκετά διαφορετικά από αυτά των άλλων τριών γονιδίων, επομένως δεν μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως εσωτερικά γονίδια αναφοράς.

Μετά την κατανόηση της συνάρτησης διόρθωσης του εσωτερικού γονιδίου αναφοράς, προκύπτουν δύο αλγόριθμοι λόγω της εισαγωγής του εσωτερικού γονιδίου αναφοράς.
· μέθοδος διπλής τυπικής καμπύλης
·2 – △△Μέθοδος Ct (μέθοδος σύγκρισης τιμών CT)
Εάν ενδιαφέρεστε να μελετήσετε είδη και λειτουργίες γονιδίων, παρακαλούμε να εγκαταλείψετε την έρευνα για αλγόριθμους και να χρησιμοποιήσετε απευθείας τύπους ή να χρησιμοποιήσετε απευθείας μηχανές.αν είστε στρέιτ τύπος στα μαθηματικά και τη μηχανική, μη διστάσετε.
μέθοδος καμπύλης διπλού προτύπου
Προσδιορίστε ποσοτικά το γονίδιο στόχο και το γονίδιο housekeeping του δείγματος ελέγχου και του δείγματος που θα ελεγχθεί μέσω της τυπικής καμπύλης και, στη συνέχεια, υπολογίστε τη σχετική τιμή σύμφωνα με τον τύπο υπολογισμού, που είναι το σχετικό επίπεδο έκφρασης.
Πλεονεκτήματα: απλή ανάλυση, σχετικά απλή πειραματική βελτιστοποίηση
Μειονέκτημα: Για κάθε γονίδιο, κάθε γύρος πειραμάτων πρέπει να κάνει μια τυπική καμπύλη
Εφαρμογή: Μία από τις δύο πιο συχνά χρησιμοποιούμενες και αναγνωρισμένες σχετικές ποσοτικές μεθόδους στη μελέτη της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης
Ο τύπος έχει ως εξής:

Παραδείγματα είναι τα εξής:

Υπολογίστε το σχετικό ποσό με βάση το ποσοτικό αποτέλεσμα
2 – △△Μέθοδος Ct (μέθοδος σύγκρισης τιμών CT)

Πλεονεκτήματα: Δεν χρειάζεται να κάνετε μια τυπική καμπύλη
Μειονεκτήματα: Υποτίθεται ότι η απόδοση ενίσχυσης είναι κοντά στο 100%.η τυπική απόκλιση είναι < 5%, και η τυπική καμπύλη και η απόδοση μεταξύ κάθε ενίσχυσης θεωρείται ότι είναι συνεπείς.η βελτιστοποίηση των πειραματικών συνθηκών είναι πιο περίπλοκη.
Εφαρμογή: Μία από τις δύο πιο συχνά χρησιμοποιούμενες και αναγνωρισμένες σχετικές ποσοτικές μεθόδους στη μελέτη της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης

Φυσικά, η απόδοση ενίσχυσης είναι συνήθως αδύνατο να είναι τέλεια 1. Μέθοδος διόρθωσης: Εάν γνωρίζουμε ότι το γονίδιο στόχος και το γονίδιο αναφοράς έχουν την ίδια απόδοση ενίσχυσης, αλλά η απόδοση ενίσχυσης δεν είναι ίση με 1, τότε το 2-△△Ct μπορεί να διορθωθεί ως: , τότε ο τύπος υπολογισμού μπορεί να διορθωθεί σε 1,95-△△Ct
Μέχρι στιγμής, το περιεχόμενο σχετικά με τη φθορίζουσα ποσοτική PCR έχει φτάσει στο τέλος της.